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通过裂域 CRISPR-Cas12a gRNA 开关进行序列独立的 RNA 传感和 DNA 靶向
CRISPR 技术越来越需要对核酸酶活性进行时空和剂量控制。一种有前途的策略是将核酸酶活性与细胞的转录状态联系起来，通过设计引导 RNA (gRNA) 使其仅在与“触发”RNA 复合后发挥作用。然而，标准的 gRNA 开关设计不允许独立选择触发和引导序列，从而限制了 gRNA 开关的应用。在这里，我们展示了 Cas12a gRNA 开关的模块化设计，它可以将这些序列的选择分离。Cas12a gRNA 的 5' 端融合到两个不同且不重叠的结构域：一个与 gRNA 重复碱基配对，阻止 Cas12a 识别所需的发夹结构的形成；另一个与 RNA 触发物杂交，刺激 gRNA 重复的重新折叠和随后的 gRNA 依赖性的 Cas12a 活性。使用无细胞转录翻译系统和大肠杆菌，我们表明设计的 gRNA 开关可以响应不同的触发因素并靶向不同的 DNA 序列。调节传感域的长度和组成会改变 gRNA 开关的性能。最后，gRNA 开关可以设计为感知仅在特定生长条件下表达的内源性 RNA，从而使 Cas12a 靶向活性依赖于细胞代谢和压力。因此，我们的设计框架进一步使 CRISPR 活性与细胞状态挂钩。
通过裂域 CRISPR–Cas12a gRNA 开关进行序列独立的 RNA 传感和 DNA 靶向
CRISPR 技术越来越需要对核酸酶活性进行时空和剂量控制。一种有前途的策略是将核酸酶活性与细胞的转录状态联系起来，通过设计引导 RNA (gRNA) 使其仅在与“触发”RNA 复合后发挥作用。然而，标准的 gRNA 开关设计不允许独立选择触发和引导序列，从而限制了 gRNA 开关的应用。在这里，我们展示了 Cas12a gRNA 开关的模块化设计，它可以将这些序列的选择分离。Cas12a gRNA 的 5' 端融合到两个不同且不重叠的结构域：一个与 gRNA 重复碱基配对，阻止 Cas12a 识别所需的发夹结构的形成；另一个与 RNA 触发物杂交，刺激 gRNA 重复的重新折叠和随后的 gRNA 依赖性的 Cas12a 活性。使用无细胞转录翻译系统和大肠杆菌，我们表明设计的 gRNA 开关可以响应不同的触发因素并靶向不同的 DNA 序列。调节传感域的长度和组成会改变 gRNA 开关的性能。最后，可以设计 gRNA 开关来感知仅在特定生长条件下表达的内源性 RNA，从而使 Cas12a 靶向活性依赖于细胞代谢和压力。因此，我们的设计框架进一步使 CRISPR 活性与细胞状态挂钩。
多发性骨髓瘤：BET蛋白水解靶向嵌合分子与CDK9抑制剂联合治疗
细胞周期蛋白依赖性激酶 9 (CDK9) 与溴结构域和末端外结构域 (BET) 蛋白结合，通过磷酸化 RNAP II C 末端结构域的丝氨酸 2 来促进转录延长。我们在体外研究了选择性 CDK9 抑制剂 (AZD 4573 和 MC180295) 对人类多发性骨髓瘤细胞的治疗潜力。与对照细胞相比，多发性骨髓瘤 (MM) 细胞系中 CDK9 的短发夹 RNA 沉默降低了细胞活力，表明 MM 细胞对 CDK9 的依赖性。为了探索与 CDK9 抑制剂的协同作用，添加了蛋白水解靶向嵌合分子 (PROTAC) ARV 825。后一种药物导致 BET 蛋白泛素化，从而导致其快速高效降解。与单独使用任何一种药物相比，ARV 825 和 AZD 4573 联合治疗 MM 细胞可显著降低其 BRD 2、BRD 4、MYC 和磷酸化 RNA pol II 的蛋白质表达。联合治疗在体外和体内协同抑制多发性骨髓瘤细胞，且体重减轻不明显。与单独使用一种药物相比，该组合还导致低剂量的凋亡细胞显著增加。总之，我们的研究首次表明 BET PROTAC（ARV 825）和 AZD 4573（CDK9 抑制剂）的组合对 MM 细胞有效。
便携式和基于核酸生物传感器的超敏HR-HPV测试
宫颈癌是全球危害女性健康的第三大最常见的癌症，高风险的人乳头瘤病毒（HR-HPV）感染是全球宫颈癌的主要原因。鉴于HR-HPV感染的复发性，准确的筛选对于其控制至关重要。由于常用的聚合酶链反应（PCR）技术受专业设备和人员的限制，因此仍然非常需要HR-HPV的方便和超敏感检测方法。作为新的分子检测方法，基于核酸扩增的生物传感器具有高灵敏度，快速运行和可移植性的优势，这有助于农村和偏远地区的护理点测试。这篇综述总结了基于改进的PCR，LOOP介导的等热放大，重物组合聚合酶放大酶放大，杂交链反应，杂化链序列，催化的毛发蛋白和CRIS的系统，促进的核酸扩增策略，用于HR-HPV筛查，用于HR-HPV筛选。与微流体技术，侧流测定，电化学分析和其他感应技术结合使用，HR-HPV核酸生物传感器具有高吞吐量，短响应时间，高灵敏度和易于操作的优势。尽管仍然存在缺点，例如高成本和差的可重复性，但这种方法适用于对HR-HPV感染或宫颈癌的现场筛查，以及未来复杂环境和较差地区的辅助临床诊断。
Silening和Gene Edition
沉默和基因版是两个有前途的分子生物学工具，它们在功能基因组学研究中变得越来越重要。基因沉默作用于信使RNA（mRNA）的水平，并且可能是瞬态或稳定的，具体取决于所使用的分子类型。临时沉默通常是由小的干扰RNA（siRNA）介导的，后者与靶mRNA结合，并借助酶复合物RISC导致其降解，因此抑制了特定基因的表达，因为不会发生翻译过程（图1）。另一方面，稳定的沉默通常用作工具，作为一种短发夹RNA（SHRNA），通常由DNA载体编码，并通过质粒转染或病毒转导将其引入细胞中。DNA载体带有转录本信息以及选择标记（例如抗生素耐药性和/或荧光标记），使用了
DROSHA，但不是人类造血干细胞功能
目标。DROSHA和DICER在microRNA（miRNA）的生物发生中具有中心作用。然而，我们先前表明，在鼠系统中，Drosha具有替代功能，可以直接识别和切割蛋白质编码的信使（M）RNA，这对于维护造血干细胞（HSC）的多能力至关重要。维持鼠HSC功能取决于Drosha介导的两个mRNA，myl9和todR1的裂解。这项研究的目的是确定该途径是否在人类HSC中保存。方法。DROSHA和DICER用短发夹RNA击倒了人绳CD34 + HSC。在体外和人类小鼠中分析了HSC的功能。通过捕获5 0磷酸化的RNA进行mRNA裂解的分析。结果。与鼠类HSC一致，Drosha敲低损害了人类HSC在体外的分化，并植入了人类小鼠，而迪切尔的敲低却没有影响。drosha在人类HSC和Drosha缺乏效率中切割MYL9 mRNA导致mRNA的积累。但是，Myl9的异位表达并不损害人类HSC的功能。 我们无法识别人类对TODR1的同源物。 结论。 DROSHA的miRNA无关函数对于人类HSC的功能至关重要。 Drosha直接识别并降低了人类HSC中的mRNA。 然而，与鼠HSC不同，仅MYL9 mRNA的降解对于人HSC功能并不是至关重要的。但是，Myl9的异位表达并不损害人类HSC的功能。我们无法识别人类对TODR1的同源物。结论。DROSHA的miRNA无关函数对于人类HSC的功能至关重要。Drosha直接识别并降低了人类HSC中的mRNA。然而，与鼠HSC不同，仅MYL9 mRNA的降解对于人HSC功能并不是至关重要的。因此，Drosha必须抑制其他靶标和/或具有另一种与miRNA无关的功能，这对于保护人类HSC的多能性至关重要。
Gregor Grill
急性髓性白血病是血液形成系统的恶性疾病。它仍然没有治疗，因此该疾病在出现第一次症状后的几个月内致命。尽管在理解白血病细胞的遗传和病理生物学过程中取得了显着的进步，但仅5年生存率的预测仍然非常糟糕。因此，迫切需要新的疗法。使用细胞系NOMO 1中的RNA干扰筛选被鉴定为程序性细胞死亡4，作为急性髓样白血病的新潜在依赖性。编程细胞死亡4是许多肿瘤标题中已建立的肿瘤抑制剂，但是这些迹象表明该蛋白质还具有组织和上下文特异性的致癌功能，到目前为止，只有少数检查涉及其在急性髓样白血病中的作用。之前的工作表明，短发夹RNA降低了编程的细胞死亡4 THP-1细胞的增殖和菌落形成。此外，可以在进一步的急性脊髓性白血病细胞系中再现生长抑制的表型，但不能在其他血液癌或实体瘤细胞中再现。提出了急性髓样白血病中程序性细胞死亡4的特定性致癌作用。使用CRISPR-CAS9技术，发现来自程序性细胞死亡4的敲除对THP-1细胞的增殖有中等影响。为了了解生长抑制作用，RNA测序和通过程序性细胞deat 4浸入的细胞和差异基因表达分析的基本机制，据称导致了鉴定。这项工作的目的是i）使用替代方法和ii）急性脊髓性白血病细胞中编程细胞死亡4-止动物的抗增殖表型，ii）潜在的程序性细胞死亡4，以验证直至最早的候选者。通过使用下一代RNA干扰技术，即改进的算法的嵌入了短发夹RNA，发现程序性细胞死亡4的部署并没有不断影响THP-1细胞的增殖。此外，结果支持以下假设：在编程细胞死亡4-耗竭后，史蛋白3赖氨酸27三甲基化，细胞外信号调节激酶1/2磷酸化和类似Tollike受体2的调节，并且可能是程序性细胞死亡4。最终将需要进一步的实验才能阐明程序性细胞死亡4在急性髓样白血病中的作用。
工程科学博士
作者：约翰·W·班德勒教授 摘要 空间映射技术现已进入其开发和利用的第 20 个年头，它是一种充分利用工程师传统的“准全局”直觉的工程设计技术。通过适当的基于物理的替代方法，空间映射技术可以实现高保真或“精细模型”模拟精度但“粗糙模型”模拟速度的设计优化。它实现了从粗糙模型的简单映射中得到的替代方法的迭代增强，以实现相应精细模型的高精度替代方法。重要的是，空间映射技术为工程师对问题的神秘“感觉”提供了定量解释。由于其特征与当代理解的大脑执行某些任务的方式相似，我们断言空间映射技术模仿了“常识”。在这里，我们介绍了这一概念，回顾了重要的进展，将其与日常人类经验进行比较，指出了当前的技术水平，并提供了来自各种工程学科的说明，包括基于电磁学的微波设备建模和设计优化。积极空间映射是最广泛使用的技术，它有效地调用了传统优化的内循环——工作中的常识——通常在可接受的两到三次迭代中产生出色的结果。设计示例包括涉及 140 个优化变量的 10 通道输出多路复用器的优化、使用隐式空间映射的微波发夹滤波器的优化以及开环环形谐振器带通滤波器的调谐空间映射。
新颖的目标，它们的设计，交付和临床潜力
包括核苷酸实体的疗法是非常广泛的类别，涵盖了核苷酸类似物，寡核苷酸和基于核酸的疗法。核苷酸/基于核苷的药物已经进行了很好的探索，临床批准的候选者是抗病毒，抗癌，抗细菌和抗毛状细胞类似（Garner，2021）。寡核苷酸疗法是相对近期且有前途的，包括反义寡核苷酸（ASOS），小型干扰RNA（siRNA），短发夹RNA（SHRNAS），抗菌毛（抗微生物）（抗MIRS）。寡核苷酸选择性地结合RNA或蛋白质，阻断其功能或促进降解。寡核苷酸疗法显示出在治疗遗传疾病，癌症，病毒感染和神经退行性疾病方面的潜力（Roberts，2020年）。目前，批准了15种寡核苷酸疗法治疗美国各种罕见疾病，其中四种批准针对Duchenne肌肉营养不良。尤其是在2020年3月，Viltolarsen的批准引起了全世界研究人员对寡核苷酸疗法的关注（Igarashi，2022年）。基于核酸的疗法包括长多核苷酸的靶向疾病，旨在调节基因表达，正确的遗传突变或干扰引起疾病的过程（Sridharan，2016）。发现CRISPR-CAS9基因编辑技术已彻底改变了基于核酸的治疗剂，但仍在研究持久的研究，以改善其递送方法，增强靶向特异性，并确保此类治疗剂的安全和效果（Udddin，2020）。发现CRISPR-CAS9基因编辑技术已彻底改变了基于核酸的治疗剂，但仍在研究持久的研究，以改善其递送方法，增强靶向特异性，并确保此类治疗剂的安全和效果（Udddin，2020）。研究人员正在努力继续探索寡核苷酸的转化潜力，同时解决了各种相关的挑战，例如特殊的挑战，交付，
组蛋白去甲基化酶GASC1抑制剂靶向GASC1基因通过NOTCH-MAPK信号通路抑制食管癌恶性转化
摘要 .目的 .食管癌是我国常见的消化道肿瘤，发病率较高。组蛋白去甲基化酶4在染色体结构修饰和基因表达调控中起重要作用，成为肿瘤治疗的新靶点。GASC1是KDM4家族的重要成员，与肿瘤的恶性程度密切相关。方法 .构建KDM4C基因（又称GASC1）的短发夹状干扰RNA质粒和空白对照质粒，分别转染人食管鳞状细胞癌细胞株（KYSE-150和KYSE-30），根据细胞活力筛选最佳治疗浓度。细胞克隆实验分析各组细胞的增殖特性。细胞迁移和划痕愈合实验分析肿瘤的恶性转移和侵袭能力。免疫荧光分析检测蛋白GASC1的表达特性。采用Western blot方法分析各组细胞株中蛋白Notch1、HIF1A、Flt-1、c-myc、c-fos的表达情况。结果.本实验通过加入咖啡酸及干扰RNA质粒调控各组GASC1蛋白的表达水平，之后通过一系列表征方法确定食管癌细胞的转移和增殖能力与GASC1蛋白表达水平呈正相关。通过测定各癌相关蛋白的表达情况，进一步证明GASC1蛋白的调控作用。结论.GASC1基因在食管癌的进展中起着至关重要的作用，通过抑制GASC1基因的表达，与癌症发展密切相关的NOTCH、MAPK等通路也会受到抑制，最终可能控制恶性发展。