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了解神经-癌症相互作用和...
神经-癌症相互作用涉及神经系统和癌细胞之间的复杂相互作用，影响肿瘤的发生、发展和转移。在神经胶质瘤中，这些相互作用主要涉及旁分泌生长因子的分泌，以及神经元和神经胶质瘤细胞之间突触介导的电化学通讯。了解此类相互作用对于开发旨在调节神经元与肿瘤通讯的新型癌症治疗策略至关重要。为此，我们使用了胶质母细胞瘤 (GB) 的体内小鼠模型，并建立了体外试验来研究神经-癌症相互作用，包括癌细胞与 hiPSC 衍生的谷氨酸能神经元或 GABA 能中间神经元的共培养，以及肿瘤球和胎儿球体的 3D 培养。hiPSC 衍生的神经元和癌细胞（包括 GB 细胞）的共培养既是接触试验，也是非接触试验，可以研究神经-癌症相互作用与癌细胞增殖和迁移的相关性。虽然 3D 球体通常可以有效地复制组织的组织和复杂性，但我们在器官球体和肿瘤球体之间进行的 3D 侵袭试验使我们能够专门检查肿瘤侵袭。GB 肿瘤球体就是一个例子，在抑制 EGFR 调控序列后，3D 脑球体的侵袭性降低。此外，共培养系统使我们能够在神经活动刺激后分析 GB 细胞的转录组和染色质可及性。与谷氨酸能神经元或 GABA 能中间神经元接触的 GB 细胞表现出不同的基因表达和染色质可及性特征。这为介导神经元与神经胶质瘤通讯的调节网络提供了新的见解，并强调了 GABA 能信号传导与 GB 发病机制的相关性。这种综合方法有望进一步加深我们对神经-癌症相互作用的理解，为靶向参与肿瘤进展的神经通路提供潜在候选者。
建立 GPR146 敲除人类诱导多能干细胞系 (ITXi001-A-1)
动脉粥样硬化性心血管疾病 (ASCVD) 仍然是全球最大的死亡原因 2 。血脂异常是与 ASCVD 发展有关的一个关键的可改变的因果风险因素。最近，G 蛋白偶联受体家族的成员 G 蛋白偶联受体 146 (GPR146) 被证明是血浆胆固醇的调节剂 3,4 。GPR146 在小鼠体内的肝脏抑制已显示出良好的特性，它对高胆固醇血症和动脉粥样硬化具有保护作用，这种作用独立于低密度脂蛋白受体 (LDLR) 通路 3 。为了更好地理解所涉及的生物学机制，我们开发了一种先进的基因工程人类诱导多能干细胞 (hiPSC) 模型，该模型因 GPR146 而无效。 GPR146 -/- 细胞系 (ITXi001-A-1) 源自我们实验室先前从尿液祖细胞 (ITXi001-A) 1 中重新编程的对照 hiPSC 的基因组版本。基因组版本使用 Alt-R™ CRISPR-Cas9 系统 (Integrated DNA Technologies) 进行，针对两个等位基因上的 GPR146 外显子 2。ITXi001-A-1 是通过挑选单个菌落建立的，其基因型通过 PCR 筛选 (图 1A - 上图和下图) 并通过 Sanger 测序确认 (图 1B)。我们进一步表明，GPR146 基因的遗传版本不会诱导基因组的脱靶版本（筛选 10 个预测位点 - （补充文件 3A）），也不会诱导 ITXi001-A-1 细胞的基因组完整性（分析 24 个拷贝数变异）（补充文件 1）。我们验证了 ITXi001-A-1 细胞不含支原体（补充文件 3B），并且它们与最初采集的尿液细胞来自同一个体（16 个 STR 的亲子鉴定 - 补充文件 2）。总体而言，ITXi001-A-1 细胞呈现：I- 与 ITXi001-A 细胞相比具有相似的形态（图 1C）II- 多能性标志物的阳性表达（通过 OCT3/4 和 TRA-1–60 的免疫荧光染色检测）（图 1D）。 III- 多能性细胞表面标志表达阳性（流式细胞术检测 SSEA-4 和 TRA1-60）（图 1E）。IV- 多能性标志物的表达水平与 ITXi001-A 细胞相同（NANOG、POU5F1 和 SOX2 - 通过 RT-qPCR 测量）（图 1F）。V- 具有优异的分化为中胚层、内胚层和外胚层的能力（通过 SOX17 和 FOXA2（中胚层）；T(TBXT) 和 HAND1（内胚层）以及 PAX6 和 SOX1（外胚层）的 RT-qPCR 评估，与 ITXi001-A 细胞相似）（图 1G）。
胰腺β细胞中RREB1的缺失会降低细胞胰岛素含量并影响内分泌细胞基因表达
摘要 目的/假设 全基因组研究发现 RREB1 基因座上的多个独立信号与 2 型糖尿病风险改变和相关血糖特征有关。然而，人们对锌指转录因子 Ras 反应元件结合蛋白 1 (RREB1) 在葡萄糖稳态中的作用或其表达和/或功能变化如何影响糖尿病风险知之甚少。 方法 使用缺乏 rreb1a 和 rreb1b 的斑马鱼模型研究 RREB1 在体内缺失的影响。利用人类 β 细胞模型 (EndoC-β H1) 和人类诱导多能干细胞 (hiPSC) 衍生的 β 样细胞的转录组和细胞表型，我们研究了 RREB1 表达和活性的丧失如何影响胰腺内分泌细胞的发育和功能。在来自 RREB1 2 型糖尿病风险等位基因携带者的供体胰岛中进行了人类胰岛功能的离体测量。结果 CRISPR/Cas9 介导斑马鱼中 rreb1a 和 rreb1b 功能的丧失支持转录因子在体内对 β 细胞质量、β 细胞胰岛素表达和葡萄糖水平的作用。RREB1 的缺失还会降低 EndoC-β H1 细胞中的胰岛素基因表达和细胞胰岛素含量，并在长期刺激下损害胰岛素分泌。RREB1 敲低和敲除 EndoC-β H1 细胞的转录组分析支持 RREB1 作为参与胰岛素分泌的基因的新调节剂。RREB1 KO/KO hiPSC 的体外分化揭示了促内分泌细胞基因（包括 RFX 家族成员）的失调，这表明 RREB1 还调节参与内分泌细胞发育的基因。来自 RREB1 中 2 型糖尿病风险等位基因携带者的人类供体胰岛在体外改变了葡萄糖刺激的胰岛素分泌，这与 RREB1 在调节胰岛细胞功能中的作用一致。结论/解释总之，我们的结果表明，RREB1 通过转录调节参与 β 细胞发育和功能的基因表达来调节 β 细胞功能。
肾脏类器官作为疾病模型
慢性肾病是全球主要的健康问题，影响着全球 10% 的人口，每年导致数百万患者死亡。因此，开发能够帮助我们了解 CKD 发病机制并改进治疗策略的模型至关重要。人类诱导多能干细胞 (hiPSC) 的发现以及最近开发出的 3D 类器官生成方法，为体外模拟人类肾脏发育和疾病以及直接在人体组织上测试新药开辟了道路。在这篇综述中，我们将讨论用于模拟疾病的肾脏类器官领域的最新进展，以及这些模型在药物筛选中的预期应用。我们还将强调 CRISPR/cas9 基因组工程对该领域的影响，指出现有类器官技术的当前局限性，并讨论一系列可能有助于克服局限性并促进将这些激动人心的工具纳入基础生物医学研究的技术发展。
通过培训促进生物信息学的可重复性
从多能干细胞（PSC）驱动有效和纯净的骨骼肌细胞分化一直在挑战。在这里，我们报告了一种优化的方案，该方案在短时间内生成具有较高效率和纯度的骨骼肌祖细胞。使用明显的和物种特异的方案将人类诱导的PSC（HIPSC）和鼠类胚胎干细胞（MESC）指定到中胚层肌原性命运中。我们使用了特定的成熟培养基来促进人和小鼠成肌细胞种群的终端分化，并生成与大量细胞周期停滞的PAX7 +细胞相关的肌管。我们还表明，肌管的成熟是通过塑性特性，细胞密度和肌源性祖细胞百分比来调节的。鉴于肌源祖细胞的产生和分化肌纤维的效率很高，该方案为组织工程，肌肉营养不良的建模以及评估体外的新治疗方法提供了有吸引力的策略。
特殊武器研讨会
摘要 努南综合征 (NS) 属于一组称为 RASopathies 的遗传性疾病，这种疾病是由影响位于典型 RAS-MAPKinase 信号通路上的基因的生殖系突变引起的。NS 是先天性心脏缺陷 (CHD) 的最常见原因之一。患有 NS 的婴儿患有心肌病和各种严重的 CHD，并且对于患有 NS 并表现出肥厚性心肌病 (HCM) 的儿童，目前尚无特定的治疗方法。此外，NS 中心脏发生缺陷背后的分子机制仍然知之甚少，因此迫切需要通过深入研究 NS 中 CHD 和心肌病的分子原因来发现治疗策略。在本次研讨会上，我将首先介绍我们如何使用人类诱导多能干细胞 (hiPSC) 衍生的心肌细胞来破译 NS 中 HCM 背后的分子通路。接下来，我将重点介绍我们为了解 RAF1 在早期人类心脏发生中的作用以及 NS RAF1 突变在此过程中的影响而做出的持续努力。最后，我将介绍我的研究计划。我将讨论如何利用基于 hPSC 的平台来研究遗传疾病中的心脏发生和心脏功能，以此作为发现导致 CHD 或心肌病的分子扰动的独特机会。
揭示HDAC6：SPG4
啮齿动物模型和人类模型之间具有实际解剖结构存在几个差异，因此与实际的人类细胞一起使用非常重要。为此，他们将human的皮肤细胞从SPG4 HSP患者中进行，将其重新编程为人类诱导的多能干细胞（HIPSC），并将其变成胚胎体，然后将它们通过后肌电（SB431542），SB431542 EGF，BFGF神经诱导造成八种不同类型的人类细胞。1。chir，胰岛素，B27就像人类大脑（无区域身份）一样。2。bdnf，nt3，iwp-2喜欢人类前脑中的那些。3。转移蛋白，孕酮，GDNF就像人类脑干中的那些一样。4。wnt3a，pms，shh，就像在人类中脑中发现的那些一样。5。视黄酸，GDF-11，就像在人脊髓中发现的那些。6。FGF19，SDF1类似于人类小脑中的SDF1。 7。 bmp-7喜欢中的那些FGF19，SDF1类似于人类小脑中的SDF1。7。bmp-7喜欢
人类多能干细胞的骨骼肌器官
各种方案已被证明可有效地将小鼠和人多能干细胞分化为骨骼肌，并用于研究肌发生。当前的2D肌源分化方案可以模仿肌肉发育及其在诸如肌肉营养不良等病理状况下的改变。3D骨骼肌分化方法还可以模拟发育中的器官中各种细胞类型之间的相互作用。我们的协议确保通过具有近似性中胚层和神经抑制剂的近端和神经抑制剂的身份和神经板板板和外瘤的有组织结构进一步产生的细胞，通过细胞通过细胞通过细胞通过细胞将人类胚胎/诱导的多能干细胞（HESC/HIPSC）分化为骨骼肌器官（SMO）。连续培养忽略了神经谱系分化并促进胎儿肌发生，包括纤维化孕育祖细胞和PAX7阳性肌源祖细胞的成熟。PAX7祖细胞类似于人类发育的晚期阶段，并且基于单细胞的转录组分析，聚集在接近原代肌肉的成年卫星细胞附近。为了克服疾病进展过程中肌肉营养不良患者的肌肉活检的有限可用性，我们建议使用SMO系统，SMO系统提供了从患者特异性IPSC中提供稳定的骨骼肌祖细胞，以研究健康和患病状况中人类肌肉的研究。
补充材料
图S1：CBIPS30-4F-5的表征人类干细胞系衍生的视网膜色素上皮细胞（RPE）表达GFP。（a，b）转导的CBIPS30-4F-5-GFP克隆的表征。（a）HIPSC菌落表达了多能标记SOX2，SSEA4，NANOG和TRA-1-60（比例尺：100 µM），（B）保持正常的46，XY karyotype。（c，d）培养中分化的HIPSC-RPE-GFP细胞的荧光激活细胞分选。（c）HIPSC-RPE细胞种群的正向与侧散射图显示出均匀的分布，侧散射与GFP荧光强度（在Abscissas中）显示了人们认为阳性的种群（在正方形中突出显示）。（d）细胞分选之前和之后培养中的HIPSC-RPE细胞。比例尺：75 µm。（E，F）通过视网膜下注射套管（直径23/38G）后HIPSC-RPE细胞的生存力测试。（E）侧散射强度与碘化丙啶的流式细胞仪定量分析图显示出极好的细胞活力率（98.65％）相似的非注射细胞（98.36％）。（f）通过套管后，hipsc-rpe细胞未损坏，培养10天后保持活跃。比例尺：75 µm。使用25/41g视网膜下注射套管获得了相似的结果（未显示）。