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在 IPSC 衍生的神经元中筛选阿尔茨海默病相关表型的修饰因子 | Charles River
hiPSC 培养：来自健康受试者的 hiPSC 系来自再生医学计划，AD hiPSC 来自 Coriell。通过 Sanger 测序和液滴数字 PCR 确认存在家族性突变。在创建主细胞库和工作细胞库之前，对所有细胞进行了活力、无菌性、细胞系身份、核型和多能性标志物表达测试。hiPSC 在基质胶上培养，如 StemCell Technologies（mTeSRTM1 手册中的人类多能干细胞维护）所述，使用 mTeSR1 作为细胞培养基和温和的解离剂进行传代。如果观察到自发分化，则使用 ReLeaSer（StemCell Technologies）来维持未分化培养。 NGN2 诱导的稳定 iPSC 的生成：健康对照和 AD 供体的 hiPSC 被编码 NGN2 的慢病毒转导，并在预定浓度的抗生素选择下放置 10 天，以生成可诱导表达 NGN2 的 hiPSC 多克隆稳定池。NGN2 稳定的 iPSC 向皮质神经元的分化：将 hiPSC 重新接种为单细胞，并通过添加强力霉素诱导 NGN2 的表达，以将 iPSC 分化为神经元前体 (NPC)。单次接种和诱导 NGN2 4 天后，将 NPC 用胰蛋白酶消化并重新接种到 PLO/matrigel 包被的 96 孔板中，密度为 30,000 个细胞/cm 2 。在 NPC 接种 2 天后，用预定的最佳浓度的 Ara-C 处理培养物以防止星形胶质细胞的出现。
人类 iPSC 衍生的肝细胞：筛选肝脏和代谢疾病候选药物的新工具
已经开发出许多旨在减少聚合物积累的治疗方法，其疗效已在临床前研究中得到证实 14 。然而，在随后的临床评估中，所有治疗方法都在不同阶段失败了。在一定程度上，这些失败是由于临床前模型不够理想。许多研究利用过表达聚合物形成型 A1AT 蛋白的 CHO 细胞在早期分类 14-16 期间进行筛选。虽然这是一种适合大规模培养的弹性模型，但其非人类来源和缺乏额外的肝脏富集蛋白损害了下游临床成功的筛选可靠性。A1ATD 患者的原代肝细胞难以获取和培养，限制了它们在小分子库筛选中的应用，直到化合物评估的最后阶段。此外，缺乏表达聚合物形成型 A1AT 蛋白的稳定细胞模型的情况因无法显示疾病表型的小鼠模型而进一步恶化，因此需要开发复杂的人源化小鼠以成功模拟体内疾病 17 。
开发源自IPSC的用于神经退行性疾病建模的IPSC的技术：通过
神经退行性疾病是成人发作的神经系统疾病，众所周知，很难对药物发现和发育进行建模，因为大多数模型无法准确地概括有关疾病相关细胞中的病理学，因此很难探索神经退行性疾病的潜在机制。因此，已经开发出人类或动物细胞的替代模型来弥合差距，并通过试图模仿神经元和神经胶质细胞相互作用以及更多的机制来更准确地预测新的治疗策略的影响。与2007年最初产生的人类诱导的多能干细胞的出现同时，可以将来自患者的人类诱导的多能干细胞（HIPSC）的可访问性区分开，可以区分与疾病相关的神经元，从而为体外建模，药物测试和治疗策略提供无与伦比的平台。最近开发了源自IPSC的三维（3D）脑器官，作为研究神经退行性疾病的病理特征的最佳替代模型。本评论重点介绍了当前基于IPSC的疾病建模的概述以及结合了神经退行性疾病的IPSC模型开发的最新进展。此外，还提出了现有的基于脑器官的疾病建模的阿尔茨海默氏病。我们还讨论了建模的区域特定脑器官的当前方法论，其潜在的应用，强调了脑器官，作为对患者特异性疾病建模，个性化疗法的建模的有前途的平台，并为持续的或未来的临床试验设计了主体技术。
iPSC 的生成、表征和稳定性 - ...
在 ElevateBio，我们提供一个集成的生态系统，提供端到端功能，将概念从实验室转化为临床。我们丰富的 iPSC 经验包括在我们的 BaseCamp 工艺开发和 cGMP 制造设施中成功验证 GMP 细胞库活动。ElevateBio 旗下公司 Life Edit 的专有基因编辑工具可用于生成新型工程 iPSC 细胞系。与我们合作使生物制药公司能够利用基因工程和细胞疗法制造方面的先进技术和专业知识，确保 iPSC 衍生疗法符合严格的监管标准，从而加速下一代基因组药物的开发。
通过引入造血祖细胞的无馈膨胀步骤
EB培养基是基于Stapel培养基（31，32）（表1）。要生成EB，使用细胞释放缓冲液（1/1000 EDTA/PBS）将IPSC细胞145酶脱离，并通过使用EB介质（表1）吸管以147天0-1（表2）来收集细胞146的团块146。通过70 µm大小的滤网将收集的细胞团过滤到50ml 148无菌管中。通过10ML血清学移液移除细胞团，并将其轻轻添加到超低149附件培养皿中（Sigma Aldrich，CAT＃CLS3261），在37°C下保持在37°C，将5％CO2 150放置在轨道振荡器上（Scientififix，CAT＃NBT-101SRC）旋转32rpm。每100mm 151盘，将2至3×10 6个细胞用于EB形成。媒体更改策略，包括152个分化因子的细节，如表2所述。为了在EB组153步骤中提高细胞活力，将0.2 nm岩石抑制剂Y-27632（Stemcell Technologies，＃72307）添加到媒体154天0-1中，并从那时起停产。从第7天开始，IPSC衍生的造血细胞开始从胚胎体作为悬浮细胞出现。156
对人类细胞模型的观点：基于CRISPR-CAS与患者衍生的IPSC模型的优势和缺点
摘要：神经遗传疾病代表具有遗传原因和临床表现差的广泛疾病。在其中，聚合酶 - γ（POLG） - 谱系疾病相对较常见，估计的疾病频率约为1：10.000。同样，POLG基因中的突变是迄今为止线粒体病的最重要原因。polg-spectrum疾病通常会导致脑功能的逐渐丧失，并且可能涉及严重和致命的脑病，癫痫发作和神经肌肉疾病，以及在某些情况下的心脏和肝衰竭。疾病的发作可能从成年到成年后期，疾病持续时间从严重病例到几十年的数周不等。 没有治疗方法；当前的动物模型不会忠实地概括Human疾病，从而使临床前治疗研究变得复杂。 必须采取基于人类的临床前模型系统来理解人类疾病机制并开发治疗方法。 在这篇综述中，我们概述了当前在人类细胞和神经元中进行神经遗传疾病的方法，重点是Polg-Spectrum疾病。 我们讨论了使用神经元细胞以及当前可用的细胞模型的影响和陷阱，即基于（i）CRISPR（i）（i。e。，遗传上有能力）并引起多能干细胞（IPSC）（I。e。e。，类似）的神经元模型（i。衍生的神经元。疾病的发作可能从成年到成年后期，疾病持续时间从严重病例到几十年的数周不等。没有治疗方法；当前的动物模型不会忠实地概括Human疾病，从而使临床前治疗研究变得复杂。必须采取基于人类的临床前模型系统来理解人类疾病机制并开发治疗方法。在这篇综述中，我们概述了当前在人类细胞和神经元中进行神经遗传疾病的方法，重点是Polg-Spectrum疾病。我们讨论了使用神经元细胞以及当前可用的细胞模型的影响和陷阱，即基于（i）CRISPR（i）（i。e。，遗传上有能力）并引起多能干细胞（IPSC）（I。e。e。，类似）的神经元模型（i。衍生的神经元。尽管根据定义，细胞模型无法概括人类疾病的各个方面，但它们仍然是发现疾病机制并开发治疗神经发生疾病的方法的合理点。
MSCs 与 iPSC：治疗应用潜力
在过去的 20 年里，间充质干细胞 (MSC) 作为一种治疗多种疾病的独特方法引起了广泛关注。MSC 具有自我更新和多谱系分化能力、免疫调节和抗炎特性，使其能够在再生医学中发挥作用。此外，MSC 的致瘤性低且具有免疫特权，这使得同种异体 MSC 可用于治疗，而无需直接从患者身上采集 MSC。诱导性多能干细胞 (iPSC) 可以通过基因重编程从成体细胞中生成，并异位表达特定的多能因子。iPS 技术的进步避免了破坏胚胎来制造多能细胞，使其免于伦理问题。iPSC 可以自我更新并发展成大量特化细胞，使其成为再生医学的有用资源，因为它们可以从任何人类来源产生。 MSC 还被用于治疗感染 SARS-CoV-2 病毒的个体。由于 MSC 具有高致瘤性（可引发致癌转化），因此其临床试验比 iPSC 多。在这篇综述中，我们讨论了间充质干细胞和诱导性多能干细胞的概况。我们简要介绍了使用 MSC 和 iPSC 的治疗方法和 COVID-19 相关疾病。
小胶质细胞中的21连锁造血基因变体赋予了阿尔茨海默氏病的人IPSC模型
A Trisomy 21-linked Hematopoietic Gene Variant in Microglia Confers Resilience in Human iPSC Models of Alzheimer's Disease Mengmeng Jin 1 , Ziyuan Ma 1 , Rui Dang 1 , Haiwei Zhang 1 , Rachael Kim 1 , Haipeng Xue 2 , Jesse Pascual 3 , Steven Finkbeiner 4,5 , Elizabeth Head 3 , Ying刘2，彭江1， * 1 1个细胞生物学和神经科学系，罗格斯大学新不伦瑞克省，皮斯卡塔维，新泽西州08854，美国2，美国2环境健康科学系罗伯特·斯蒂姆佩尔公共卫生与社会工作学院，佛罗里达州佛罗里达州国际学院，佛罗里达州佛罗里达州佛罗里达州佛罗里达州佛罗里达州佛罗里达州佛罗里达州教学，3498777777777777.987777777777777777777.79877777777777777777.7987， Irvine，CA 92697，美国4 CETER，用于系统和治疗学以及Taube/Koret神经退行性疾病中心，Gladstone Institutes；加利福尼亚大学，旧金山，加利福尼亚州94158，美国5个神经病学和生理学系，加利福尼亚大学旧金山，美国加利福尼亚州94158，美国 *地址通信到：Peng Jiang，Ph.D。细胞生物学和神经科学副教授系罗格斯大学新不伦瑞克604 Allison Road，Piscataway，NJ 08854电子邮件：peng.jiang@rutgers.edu电话：848-445-2805
诱导性多能干细胞 (iPSC) 和基因治疗
摘要：迄今为止，基因治疗一直采用病毒载体来传递治疗基因。然而，分子和细胞生物学的最新进展彻底改变了干细胞和基因治疗领域。几年前，临床试验开始使用干细胞替代疗法，诱导多能干细胞 (iPSC) 技术与 CRISPR-Cas9 基因编辑相结合，开启了神经系统疾病基因治疗的新时代。在这里，我们总结了该研究领域的最新发现并讨论了它们的临床应用，强调了最近的研究在开发创新干细胞和基因编辑治疗方法方面的相关性。尽管致瘤性和免疫原性是现有的障碍，但我们报告了最近的进展如何解决它们，使工程干细胞移植疗法成为一种现实的选择。