XiaoMi-AI文件搜索系统
World File Search Systemknock
基因敲除技术在细菌耐药性研究中的应用进展
其缺陷主要有：（1）对DNA片段浓度要求较高，尤其对于一些细胞膜致密的菌株，由于摄取效率低，进入细胞的DNA量往往达不到同源重组的最低标准，导致基因敲除失败。而且电转化会造成大量细胞死亡，而剩余的细胞达不到所需浓度，导致敲除失败。（2）Red系统需要从菌体中消除重组酶表达载体，以便后续引入另一个表达FLP重组酶的载体，该载体需要再次消除，最终产生无标记突变体。总之，这种基于λ-Red重组的方法
生成多种遗传背景下的基因敲除小鼠的通用方法2
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可证下提供（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者此版本于 2023 年 4 月 10 日发布。；https://doi.org/10.1101/2023.04.10.536207 doi：bioRxiv 预印本
CRISPR/CAS9介导的基因组敲除酪氨酸羟化酶和板球bimaculatus中的黄色基因
gryllus bimaculatus是一种生物学领域的新兴模型生物，例如行为，神经病学，生理学和遗传学。最近，反向遗传学的应用为理解具有特定生理反应的基因调查网络的功能基因组学和操纵基因调节网络提供了机会。bimaculatus。在g中使用CRISPR/ CAS9系统。bimaculatus，我们提出了与昆虫黑色素和儿茶酚胺生物合成途径有关的酪氨酸羟化酶（Th）和黄色Y的有效敲低。作为一种酶，将酪氨酸转化为3,4-二羟基苯基甲基甲基甲烷，限制了途径中的第一步反应。黄色蛋白质（Dopachrome Convertion酶，DCE）也参与黑色素生物合成途径。色素沉着中黑色素生物发生的调节系统和分子机制及其在G中的物理功能。bimaculatus尚未因缺乏体内模型而被很好地定义。在F 0个个体和可遗传的F 1后代都检测到核苷酸的缺失和核苷酸核苷酸的插入。我们确认通过定量的实时PCR分析在突变体中下调了Th和Yel-Y-Y。与对照组相比，Th和黄色基因的突变导致色素沉着缺陷。大多数F 0若虫具有第一个幼体的基因突变，而唯一的成年人在机翼和腿部有很明显的缺陷。但是，我们无法获得第一个龄的所有F 2死亡的TH突变体的任何纯合子。bimaculatus。因此，基因对于G的生长和发展非常重要。当将黄色基因拆除时，g时为71.43％。bimaculatus是浅棕色，腹部有轻微的镶嵌物。黄色基因可以通过杂交实验稳定地遗传，没有明显的表型，除了较轻的表皮颜色。目前的功能研究表明，Th和黄色在色素沉着中的基本作用，TH具有多巴胺合成在G中胚胎发育中的深远而广泛的作用。bimaculatus。
Cas12a/Cpf1 敲入小鼠可实现高效多路复用......
1. 美国康涅狄格州纽黑文耶鲁大学医学院遗传学系 2. 美国康涅狄格州西黑文耶鲁大学系统生物学研究所 3. 美国康涅狄格州西黑文耶鲁大学癌症系统生物学中心 4. 医学博士 (MD-Ph.D.)耶鲁大学免疫生物学项目，美国康涅狄格州西黑文 5. 耶鲁大学免疫生物学项目，美国康涅狄格州纽黑文 6. 耶鲁大学免疫生物学系，美国康涅狄格州纽黑文 7. 耶鲁大学分子细胞生物学、遗传学与发展项目，美国康涅狄格州纽黑文 8. 耶鲁大学耶鲁学院，美国康涅狄格州纽黑文 9. 耶鲁大学医学院神经外科系，美国康涅狄格州纽黑文 10. 耶鲁大学医学院耶鲁综合癌症中心，美国康涅狄格州纽黑文 11. 耶鲁大学医学院耶鲁干细胞中心，美国康涅狄格州纽黑文 12. 耶鲁大学医学院耶鲁生物医学数据科学中心，美国康涅狄格州纽黑文 ^ 现地址：中国湖南长沙湘雅医学院 * 共同第一作者 @ 通信：
高效的敲入方法能够实现谱系追踪...
在这里，我们设计了一种无需克隆的 39 敲入策略，用于斑马鱼，使用 PCR 扩增的 dsDNA 供体，避免破坏目标基因。dsDNA 供体携带编码荧光蛋白和 Cre 重组酶的遗传盒，与内源基因同框，但被可自裂解的肽与其隔开。具有 59 AmC6 末端保护的引物产生了具有更高整合效率的 PCR 扩增子，这些扩增子与预组装的 Cas9/gRNA 核糖核蛋白复合物共注射以进行早期整合。我们针对四个基因位点（krt92、nkx6.1、krt4 和 id2a）并生成了 10 个敲入系，它们可作为内源基因表达的报告基因。敲入 iCre 或 CreERT2 的细胞系用于谱系追踪，结果表明 nkx6.1 + 细胞是多能性胰腺祖细胞，逐渐局限于双能性导管，而 id2a + 细胞在肝脏和胰腺中都是多能性细胞，逐渐局限于导管细胞。此外，肝脏 id2a +
人类 T 细胞的大规模并行敲入工程
靶向基因敲入在细胞治疗中的应用效率普遍较低，规模有限。本研究开发了CLASH系统，该系统能够实现高效、高通量的基因敲入工程。在CLASH中，Cas12a/Cpf1 mRNA与混合腺相关病毒结合，通过大规模并行同源定向修复介导同时基因编辑和精准转基因敲入，从而产生一个稳定整合的突变变体池，每个变体都具有靶向基因编辑功能。我们将该技术应用于原代人T细胞，并使用CD3、CD8和CD4 T细胞在血癌和实体瘤模型中进行了时间进程式CLASH实验，从而实现了有利的CAR-T变体的混合生成和无偏选择。 CLASH 实验中出现了一种独特的 CRISPR RNA (crRNA)，它可以在 CAR-T 中生成 PRDM1 的外显子 3 跳跃突变，从而增强这些细胞的增殖、干细胞样特性、中枢记忆和寿命，从而在多种癌症模型（包括实体瘤模型）中提高体内疗效。CLASH 的多功能性使其广泛应用于各种细胞和治疗工程应用。
在哺乳动物干细胞中利用通用供体进行高效、快速的荧光蛋白敲入
摘要 荧光蛋白 (FP) 标记是细胞生物学的基础方法，因为它可以观察活细胞中的蛋白质分布、动态和与其他蛋白质的相互作用。然而，使用标记蛋白过表达的典型方法可能会扰乱细胞行为并引入定位伪影。为了保持天然表达，可以将荧光蛋白直接插入内源基因中。这种方法在酵母中已经是标准做法几十年了，最近随着 CRISPR/Cas9 的出现，在无脊椎动物模型生物中也成为标准做法。然而，由于同源定向修复 (HDR) 效率低下，内源荧光蛋白标记尚未在哺乳动物细胞中广泛使用。在这里，我们描述了一种简化的方法，用于通过小鼠胚胎干细胞中的非同源末端连接 (NHEJ) 将 FP 标签高效快速地整合到天然基因座中。我们的方案最大限度地减少了使用通用供体的克隆，允许对内源蛋白进行 N 端或 C 端标记，并且从转染到成像只需不到 2 周的时间，从而提高了 FP 敲入在哺乳动物细胞中的适用性。简介荧光蛋白（FP）敲入能够实现内源性标记，从而实现蛋白质可视化，而不会产生过表达伪影1。敲入策略可以让研究人员准确观察和测量活细胞中蛋白质表达、定位和相互作用的动态。自20世纪90年代以来，FP敲入一直是酵母中的标准做法，因为这种生物可以通过同源重组有效地整合FP供体2,3。最近，由于CRISPR/Cas9技术的出现10，FP敲入已在秀丽隐杆线虫4-7和果蝇8,9中得到广泛采用。当由单向导RNA（sgRNA）编程时，Cas9会引入靶向的DNA双链断裂（DSB），细胞可以通过同源定向修复（HDR）或非同源末端连接（NHEJ）11进行修复。HDR因其高保真度而受到青睐12-15。然而，HDR 仅在某些细胞周期阶段 16 活跃，并且需要与靶标匹配的同源臂。因此，基于 HDR 的标记效率要低得多 17,18，并且需要在哺乳动物细胞中费力地克隆。为了规避这些限制，最近已引入 NHEJ 来在哺乳动物细胞中进行 FP 敲入 18–26 。一种名为 CRISPR 辅助插入标记 (CRISPaint) 22 的方法特别精简，因为它使用通用供体质粒，因此唯一需要的克隆是构建基因特异性 sgRNA。供体质粒通过转染引入细胞，与靶基因并行被 Cas9 切割，并通过 NHEJ 以非序列特异性的方式整合到靶基因中。为了允许使用任何基因特异性 sgRNA 同时保持正确的阅读框架，CRISPaint 使用通用的“框架选择器”在三种可能的阅读框架之一中切割通用供体 22 。尽管有这些优势，到目前为止，CRISPaint 仅在少数细胞系中进行了测试。此外，目前形式的 CRISPaint 系统仅可进行 C 端插入，这限制了其应用于蛋白质产物可耐受 C 端标记的基因。在这里，我们描述了一种基于 CRISPaint 的改进方法，该方法可在哺乳动物细胞中灵活、快速地在基因的任一端进行 FP 标记。我们的方法高效，需要的克隆最少，并且可以产生在天然调控元件的控制下表达的功能性内源性标记蛋白。我们在小鼠胚胎干细胞 (mESC) 中测试并优化了这种方法。我们在第一次尝试中成功标记了 5/5 个目标，从转染到成像的时间只有 2 周。此外，我们还构建了一组用于多色标记的质粒。总之，这些进展将促进 mESC 和其他哺乳动物细胞中的细胞生物学研究，并可能提供更快、更简单的快速创建敲入小鼠的途径。
CRISPR 介导的 TGFBR2 敲除使人类卵巢癌肿瘤浸润淋巴细胞对 TGF-β 信号产生抗性
摘要 背景 卵巢癌 (OvCa) 患者 T 细胞浸润升高与生存率提高之间的相关性表明内源性肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL) 具有一定程度的抗肿瘤活性，可用于 OvCa 免疫治疗。我们之前优化了一种体外 OvCa TIL 扩增用于过继细胞疗法的方案，该方案目前正在我们机构的临床试验中进行测试 (NCT03610490)。在此成功的基础上，我们开始对 OvCa TIL 进行基因改造，以克服肿瘤微环境中存在的关键免疫抑制因素。在这里，我们介绍了在患者来源的 OvCa TIL 中 CRISPR/Cas9 介导的 TGF-β 受体 2 (TGFBR2) 敲除的临床前优化。方法 从四名患者手术切除的肿瘤样本中生成 OvCa TIL，并进行 CRISPR/Cas9 介导的 TGFBR2 敲除，然后进行快速扩增方案。全面评估了 TGFBR2 定向 gRNA 的 TGFBR2 敲除效率和脱靶活性。此外，还测定了 TGFBR2 敲除对 TIL 扩增、功能和下游信号传导的影响。结果在四个独立的 OvCa TIL 样本中测试的 5 个 gRNA 实现了从 59±6% 到 100%±0% 的 TGFBR2 敲除效率。TGFBR2 敲除的 TIL 对免疫抑制 TGF-β 信号传导具有抗性，表现为缺乏 SMAD 磷酸化、缺乏对 TGF-β 刺激的整体转录变化、在有和没有 TGF-β 的情况下促炎细胞因子的分泌同样强烈、并且在存在 TGF-β 的情况下细胞毒性增强。CRISPR 修饰本身不会改变 OvCa TIL 的体外扩增效率、免疫表型或 TCR 克隆多样性。对于临床转化而言，重要的是，对 CRISPR 脱靶效应的全面分析表明，我们前两个靶向 TGFBR2 的 gRNA 没有脱靶活性的证据。结论 CRISPR/Cas9 介导的基因敲除在患者来源的 OvCa TIL 中是可行且有效的，可使用临床可扩展的方法。我们实现了高效且特异性的 TGFBR2 敲除，产生了一种扩增的 OvCa TIL 产品，该产品对免疫抑制剂具有抗性
拆解收购机会来临 - AviTrader
在过去十年中，许多非洲航空公司实施了机队战略，以避免成为老旧飞机的倾倒场，我们已经看到一些航空公司通过购买新技术飞机彻底改造了他们的机队，但这也将给航空公司带来新的 MRO 挑战。在最近于南非约翰内斯堡结束的 MRO Africa 2022 活动之后，人们非常重视非洲航空运输市场的未来增长，并确定新飞机是非洲航空公司和 MRO 合作的机会，不断增长的需求是 MRO 发展业务的推动力。在约翰内斯堡的活动中，非洲航空协会 (AFRAA) 谈到了包括 Brown Condor 计划在内的重要举措，该计划旨在帮助 AFRAA 成员通过在美国市场销售非洲 MRO 能力和过剩备件库存来创造收入。该项目针对四家 MRO：埃塞俄比亚航空、肯尼亚航空、SAA Technical 和埃及航空。埃塞俄比亚航空和埃及航空已经签署了该协议。有趣的是，截至本文发稿时，Joramco 宣布已达成协议，支持建立 Aerojet 航空培训学院，为加纳和该地区提供飞机维修方面的高级研究。为期四年的飞机维修课程分为理论和实践培训，旨在培养第一批未来的飞机维修工程师，让他们拥有经验和信心，立即加入正在加纳建立的 Aerojet MRO 工厂的工作队伍。我们将密切关注非洲 MRO 伙伴关系的机会和发展。
基于 CRISPR-del 的人类基因完全敲除流程 1
。CC-BY-NC 4.0 国际许可，根据 （未经同行评审认证）提供，是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者，此版本于 2022 年 5 月 27 日发布。；https://doi.org/10.1101/2021.06.21.449335 doi：bioRxiv 预印本