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Cas12a 在解脂耶氏酵母中起指导作用
摘要 全基因组功能性遗传筛选已成功发现基因型-表型关系并设计新表型。虽然广泛应用于哺乳动物细胞系和大肠杆菌，但在非常规微生物中的使用受到限制，部分原因是无法准确设计此类物种的高活性 CRISPR 向导。在这里，我们开发了一种针对所选生物体（在本例中为产油酵母解脂耶氏酵母）的 sgRNA 设计实验计算方法。在不存在非同源末端连接（主要的 DNA 修复机制）的情况下进行负选择筛选，用于生成 SpCas9 和 LbCas12a 的单个向导 RNA (sgRNA) 活性谱。这种全基因组数据作为深度学习算法 DeepGuide 的输入，该算法能够准确预测向导活性。 DeepGuide 使用无监督学习来获取基因组的压缩表示，然后通过监督学习来映射具有指导活性的 sgRNA 序列、基因组背景和表观遗传特征。全基因组和选定基因子集的实验验证证实了 DeepGuide 能够准确预测高活性 sgRNA。DeepGuide 提供了一种生物体特异性的 CRISPR 指导活性预测因子，可广泛应用于真菌物种、原核生物和其他非常规生物。
解脂耶氏酵母中 DNA 复制起点的指定
尽管与高等真核生物存在差异，但解脂耶氏酵母由于其基因组较小，为研究复制提供了一个简化的模型，使其成为识别起源指定所涉及的关键步骤和成分的理想系统。在这项研究中，我使用高通量测序、基因操作和生化方法表征了解脂耶氏酵母所有六条染色体上的复制起源。结果揭示了一种新的序列基序 YATR......C.AWTT......Y.YAA，其中包括对 ORC 和 CDC6 结合至关重要的大沟和小沟接触。功能分析证实，破坏这些接触会消除起源活动，强调了该基序在复制起始中的关键作用。结构特征（例如 DNA 弯曲）也被发现对起源功能至关重要，突出了序列背景和结构可塑性在复制起始中的重要性。这些发现弥补了复制生物学中的关键知识空白，使解脂耶氏酵母成为理解真核 DNA 复制的宝贵模型。
通过代谢工程增强Yarrowia脂肪素的胃生产
此预印本版的版权持有人于2024年3月11日发布。 https://doi.org/10.1101/2024.03.10.584284 doi：Biorxiv Preprint
比较Yarrowia脂溶作β-胡萝卜素生产中应用的代谢工程策略
摘要，以更好地了解β-芳特烯的健康益处，维生素A的前体及其着色特性，对这种类胡萝卜素的需求在各个部门都增加了。为了有效，便宜和可持续地满足需求，通过代谢工程策略对异源β-胡萝卜素生产的兴趣有所增加。在这种情况下，尽管它不是β-胡萝卜素的本地生产国，但脂溶性酵母菌的代谢，生理和基因组特性却脱颖而出。通过使用一系列工程策略，包括生物合成途径工程，形态工程和发酵工程策略，从而获得了成功的结果。脂溶剂。但是，这些策略彼此之间具有各种优势和弱点，并且也有一些开放的进步。在这篇综述中，已应用的工程策略有可能用于从Y生产β-胡萝卜素的可能性。脂溶性已深入研究，包括它们的优势和缺点，并相互比较。此外，已经提出了未来的观点，以提高使用Y的潜力。脂溶性酵母作为β-芳特烯生产中的细胞工厂。
一流的 - yarrowia脂溶剂中的6-MSA和Bostrycoidin的生物合成
真菌聚酮化合物是一大批二级代谢产物，由于它们的药理活性多样，很有价值。纤维化真菌中的聚酮化合物生物合成提出了一些挑战：小产量和低纯度滴度。为了解决这些问题，我们改用了易于栽培的异源宿主的酵母Yarrowia Lipolytica。作为润滑脂酵母，脂溶作脂溶剂显示出用于脂质合成中使用的乙酰基和丙二酰-COA前体。同样，乙酰基和丙二酰辅酶A是许多天然聚酮化合物的基础，我们探索了将这种漏斗重定向到聚酮化合物生产的可能性。尽管有前途的前景，但Y. lipolytica到目前为止仅用于植物中简单的III型聚酮化合物合酶（PKS）的异源表达。因此，我们决定通过靶向由I型PKS合成的更复杂的真菌聚酮化合物来评估Y.脂溶液的潜力。我们采用了CRISPR-CAS9介导的基因组编辑方法来实现负责索拉尼（FSR1，FSR2和FSR2和FSR3）和6-甲基酸（6-MSA）生物合理的基因（FSR1，FSR2和FSR2）和6-甲基酸（6-MSA）生物合理的基因的基因整合。此外，我们通过代谢工程过度表达了两种参与脂质B氧化的酶TGL4和AOX2，从而尝试通过代谢工程进行优化，但我们没有观察到对聚酮化合物产生的影响。最大滴度为403 mg/L 6 msa和35 mg/L bostrycoidin，后者大大高于我们先前在酿酒酵母（2.2 mg/l）中的结果，这项工作证明了Y. lipolytica的潜力，是Y. lipolytica作为复杂型Fungal Polygal Polygelidides的杂同生产的平台。
使用优化的yarrowia脂溶液表达系统
yarrowia lipolytica是异源蛋白质产生的替代酵母。Based on auto-cloning vectors, a set of 18 chromogenic cloning v ectors w as dev eloped, each containing one of the excisa b le auxotr ophic selecti v e markers URA3 e x, LYS5 e x, and LEU2 e x, and one of six different promoters: the constitutive pTEF, the phase dependent hybrid pHp4d, and the来自PEYK1和PEYL1 deri v ati v es的红氨酸诱导启动子。这些V eTor允许提高感兴趣基因的克隆速度。同时，通过废除细丝并引入了赖氨酸（LYS-）的合理性，开发了一种新的RPROT受体菌株JMY8647，这是基因工程的附加标记。使用此克隆str at gy，这是根茎的最佳靶向序列，如确定。与用野生型ROL信号序列相比，在八个靶向序列中，SP6信号序列在脂肪酶活性中提高了23％。使用杂种Ythritol-inducib le pr opters phu8eyk和peyl1-5ab（1.9和2.2次）与constituti v e ptef pr emoter进行比较时，使用YTHRITOL-Inducib le premoters phu8eyk和Peyl1-5ab（Peyl1-5ab）进行。 两次拷贝str ains在PTEF单子镜菌株上产生3.3倍的脂肪酶活性（266.7对79.7 mu/mg）。。两次拷贝str ains在PTEF单子镜菌株上产生3.3倍的脂肪酶活性（266.7对79.7 mu/mg）。
系统级别的方法，用于理解和工程的oleteos cell厂yarrowia脂溶剂
图1 Yarrowia脂溶性固体箭头中脂质代谢的概述：化学转换和运输反应，虚线箭头：多个化学转换步骤，虚线和箭头：代表N-限制后果。AMP，单磷酸腺苷； CIT，柠檬酸盐； DAG，二酰基甘油； DHAP，二羟基丙酮磷酸盐； F6P，果糖6-磷酸盐； FA，脂肪酸； FBP，果糖1,6-双磷酸；烟雾，富马酸； G3P，甘油3-磷酸盐； G6P，葡萄糖6-磷酸盐； GA3P，3-磷酸甘油醛； ICIT，异核酸； Imp，肌苷一磷酸； LPA，溶物磷脂酸；马尔，苹果； mal -coa，丙二酰辅酶A; NH4，铵； OAA，草乙酸； PA，磷脂酸； pyr，丙酮酸； suc，琥珀酸；标签，三乙二醇[可以在wileyonlinelibrary.com上查看颜色图]AMP，单磷酸腺苷； CIT，柠檬酸盐； DAG，二酰基甘油； DHAP，二羟基丙酮磷酸盐； F6P，果糖6-磷酸盐； FA，脂肪酸； FBP，果糖1,6-双磷酸；烟雾，富马酸； G3P，甘油3-磷酸盐； G6P，葡萄糖6-磷酸盐； GA3P，3-磷酸甘油醛； ICIT，异核酸； Imp，肌苷一磷酸； LPA，溶物磷脂酸；马尔，苹果； mal -coa，丙二酰辅酶A; NH4，铵； OAA，草乙酸； PA，磷脂酸； pyr，丙酮酸； suc，琥珀酸；标签，三乙二醇[可以在wileyonlinelibrary.com上查看颜色图]
氟康唑抗性的解脂耶氏酵母临床分离株 CBS 18115 的基因组序列草图
arrowia lipolytica 属于子囊菌门、酿酒菌亚门和双足菌科 (1)。除了工业用途 (2) 之外，Y. lipolytica 还广泛存在于食品、环境和动物中 (1)。由于其能够在 32°C 以上不稳定地生长，因此通常认为该菌种可安全用于工业用途 (1)。Yarrowia lipolytica 是一种机会性病原体，可引起侵袭性念珠菌病 (3)。在体外，该菌种被认为对氟康唑敏感 (4)。第一个 Y. lipolytica 基因组 (CLIB122) 于 2004 年发布 (5)。我们报告了对氟康唑有抗性的 Y. lipolytica 临床分离株的基因组草图，该分离株是从溃疡性结肠炎手术后的血培养中采集的。有趣的是，尽管之前曾接触过唑类药物，但使用梯度浓度试纸法（Etest；bioMérieux），该菌株的氟康唑 MIC 为 0.256 mg/mL。患者成功地用卡泊芬净治疗。该菌株在 35°C 的显色琼脂平板（CAN2；bioMérieux）上生长，并使用 Vitek 基质辅助激光解吸电离 - 飞行时间质谱 (MALDI-TOF MS) 仪器（bioMérieux）进行鉴定。在溶菌酶细胞壁消化后，使用 QIAmp DNA minikit（Qiagen）提取基因组 DNA。使用 Illumina DNA 制备标记试剂盒（Illumina）构建文库。简而言之，使用珠状转座子技术和集成 DNA 技术 (IDT) 的 Illumina DNA/RNA 独特双重 (UD) 索引集将 30 ng 总 DNA 片段化并进行索引。使用 Qubit 高灵敏度试剂盒 (Thermo Fisher Scienti ) 对文库进行扩增、纯化和定量。最后，将 9 pM 汇集和变性文库放入 2 250-bp v2 试剂盒 (Illumina) 中，并使用 MiSeq 仪器 (Illumina) 进行测序。使用 CLC Genomics Workbench v22.0 (Qiagen) 中的 Trim Reads v2.5 和 De Novo Assembly v1.5 工具对原始读取进行修剪、组装成重叠群并进行搭建。使用覆盖率与长度图丢弃覆盖率为 , 10 且长度为 , 500 bp 的重叠群 (6)。使用 QUAST v5.0.2 对最终的 scaffold 集进行质量分析 (7)。总基因组大小为 20,255,408 bp，分布在 521 个 scaffold 上（覆盖率为 100 ），N 50 值为 105 kbp（最长 scaffold，397 kbp），GC 含量为 49.03%。AUGUSTUS v3.4.0 (8) 使用白色念珠菌训练数据集预测了 6,151 个蛋白质编码基因，使用 tRNAscan-SE 2.0 检测到了 484 个 tRNA 基因 (9)。使用 BUSCO v5.3.2 和 saccharomycetes_odb10 谱系数据集 (10) 估计基因组完整性为 95.3%。平均核苷酸同一性 (ANI) 计算
一组用于利用野生型菌株多样性的解脂耶氏酵母 CRISPR/Cas9 载体
摘要 目的 构建和验证一组含有六种不同标记的解脂耶氏酵母 CRISPR/Cas9 载体，可编辑几乎任何遗传背景，包括野生型菌株的遗传背景。 结果 使用 Golden Gate 方法，我们组装了一组六个 CRISPR/Cas9 载体，每个载体含有不同的选择标记，用于编辑工业酵母解脂耶氏酵母的基因组。此载体组可通过 Addgene 获得。使用 Golden Gate 组装，可以轻松快速地将任何向导 RNA (gRNA) 序列引入这些载体中的任何一个。使用这六个载体中的五种，我们成功地编辑了各种遗传背景（包括野生型菌株）中的六种不同基因。使用这些载体大大改善了特定位点的同源重组和盒式整合。结论我们已经创建了一套多功能、模块化的 CRISPR/Cas9 载体，可以快速编辑任何解脂耶氏酵母菌株；该工具将
解脂耶氏酵母Γ-癸内酯代谢关键基因POX3特异性敲除优化策略
摘要：γ-癸内酯作为重要的香料原料，在食品工业中有着广泛的应用。6个过氧化物酶体酰基辅酶A氧化酶（POX）是解脂耶氏酵母中γ-癸内酯代谢的限速酶，但该家族各成员的功能均存在诸多未解决的问题，限制了γ-癸内酯的菌株优化和工业产能效率。本研究在对POX1~POX6的ORF及Flanking序列保守性分析的基础上，基于Cre/LoxP系统设计特异性较高的基因敲除验证引物，基于CRISPR/Cas9系统筛选出2个特异性较高的靶位，实现解脂耶氏酵母POX3基因的特异性敲除，旨在探究POX3的功能，进而细化γ-癸内酯的生产工艺。该研究结果为γ-癸内酯的微生物生产能力提供了新的基因工程设计思路，深入揭示POX基因家族的功能，有助于优化γ-癸内酯的生产效率，为工业化应用奠定理论基础。