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木糖基转移酶凸起和孔工程，以化学操纵哺乳动物细胞的蛋白聚糖
。cc-by-nc-nd 4.0国际许可证（未获得同行评审证书）获得的是作者/资助者，他已授予Biorxiv授予Biorxiv的许可，以永久显示预印本。这是该版本的版权所有，该版本发布于2024年6月27日。 https://doi.org/10.1101/2023.12.20.572522 doi：Biorxiv Preprint
基于微型微镜的哺乳动物脑组织的密集连接组重建
摘要：大脑细胞网络的信息处理能力取决于神经元及其分子和功能特征之间的物理布线模式。映射神经元并解决其单个突触连接可以通过在纳米级分辨率下以密集的细胞标记在纳米级分辨率下实现。光学显微镜独特地定位于可视化特定的分子，但是由于分辨率，对比度和体积成像能力的限制，光学显微镜的密集，突触级的电路重建已经无法触及。在这里，我们开发了基于光微镜的连接组学（LICONN）。我们将专门设计的水凝胶嵌入和扩展与基于深度学习的分割和连通性分析进行了整合，从而将分子信息直接纳入突触级脑组织重建中。liconn将允许以易于采用的方式在生物学实验中进行突触级的脑组织表型。
定量分析和优化哺乳动物细胞中位点特异性蛋白生物结合
摘要：尽管有多种共价蛋白质修饰，但很少有用于定量细胞中蛋白质生物结合的技术。在这里，我们描述了一种通过与Halotag共价键形成在纤维素蛋白生物偶联中量化的新方法。这种方法利用不自然的氨基酸（UAA）诱变选择性地在蛋白质表面上安装小而生物串管的反应性手柄。我们利用了反电子二极管的快速动力学和高选择性 - 评估四嗪苯丙氨酸（TETF）与紧张的反甲环烯 - 氯酸酯（STCO-CA）（STCO-CA）和跨循环链烯（TETR-caclecten）（TETR-CATRE）的反应（TETF）与TETRECANE（TETRE）（TETER-CARORE（TETRE）。生物缀合后，叶绿素配体暴露于释放酶标记，以通过简单的蛋白质印迹分析直接定量生物缀合。我们证明了该工具的多功能性，以快速，准确地确定不同UAA/氯烷烃对的生物缀合效率以及对不同蛋白质的不同位点（包括EGFP和雌激素相关的受体ERR）的不同位点。■简介
硫化氢在哺乳动物细胞，组织和器官中的生理作用
H 2 S现在被认为是多种哺乳动物细胞和组织中的内源性生理调节剂。Produced, in a regulated and cell type-dependent manner, by three major enzyme systems, cystathionine c -lyase (CSE), cystathio- nine b -synthase (CBS), and 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase (3-MST), H 2 S is present intra- and extracellularly and interacts with proteins, DNA, and other members of the reactive species interactome （例如，氧和氮衍生的氧化剂和自由基）并在各种目标和途径上发挥作用。H 2 S的生理作用在基因转录和翻译，细胞生物能学和代谢，血管张力和免疫功能中的调节中得到充分认识，在中枢神经系统和周围神经系统的各种功能以及与生理学家和临床医生相关的许多其他领域的调节中。本综述对H 2 S在哺乳动物细胞和器官中的生理调节作用进行了全面概述。在生理状况下对这些作用的理解以及对H 2 S稳态的扰动的日益了解（例如，血管疾病，血管疾病，代谢性疾病，各种形式的中枢神经系统疾病，各种形式的中枢神经系统疾病，对跨性别疾病的疾病，其他机构的疾病以及其他机理疗法的诊断和诊断的新机会。在这种情况下，基于H 2 s的替换（通过H 2 s-释放的小分子）的新型实验治疗方法已经出现，并正在转化为临床竞技场。在本综述中突出显示，由于生物合成和/或降解增加，在某些疾病中，H 2 S水平在病理上降低了（例如，再灌注损伤，动脉粥样硬化，动脉粥样硬化以及许多其他形式的血管疾病，以及衰减）。在其他疾病（例如，各种形式的炎症，唐氏综合症和癌症）中，H 2 S水平增加，并且抑制H 2 S产生酶正在作为一种实验性治疗方法出现。进一步了解H 2 S的生理调节作用，再加上旨在调节H 2 S稳态的小分子的药理学和翻译科学的进步，预计将来会产生新颖的诊断和临床疗法方法。
从哺乳动物细胞和固定组织中分离基因组DNA从哺乳动物细胞和固定组织中分离基因组DNA
获得用于遗传研究的DNA已成为几乎所有生物医学研究的重要组成部分。本单元为全血，人体组织，培养细胞和唾液/颊拭子的简单，成本效益的DNA制备提供了更新。使用新鲜或冷冻样品时，可以常规地分离出适合下游测定法的高分子重量DNA，例如基因分型阵列或下一代测序。DNA也可以从福尔马林固定的石蜡装置（FFPE）组织中分离出来，尽管它更具挑战性，并且在下游应用中存在局限性，该DNA适合使用。在过去的几十年中，商业套件的可用性和成本降低使它们在该领域中的使用引起了人们的关注。有许多提供类似类型的提取套件的供应商，这是从人类标本中获得高质量DNA的一种经济高效的选择。大多数商业上可用的提取方法不再需要使用有毒化学物质，例如苯酚和氯仿，也使它们成为研究人员的更安全选择。商用套件通常在DNA的产量和质量方面具有手动方法（Chacon-Cortes＆Griffiths，2014; Guha等，2018）。基本协议1描述
发育中的哺乳动物脑皮质中的多个平行细胞谱系
皮质神经发生遵循一个简单的谱系：顶端radial胶质细胞（RGC）产生基础祖细胞，这些产生神经元。在具有扩展的生发区域和折叠皮层（例如人类）的物种中，这种情况如何发生。我们使用了来自雪貂和条形码谱系跟踪中单个皮质生发区域的单细胞RNA测序来确定祖细胞及其谱系的分子多样性。我们确定了启动并行谱系的多个RGC类，并收敛到一类新生神经元。平行的RGC类和转录组轨迹在生发区域重复，并在雪貂和human中保守，但在小鼠中不保守。神经元遵循回旋和沟中的平行分化轨迹，具有人类皮质畸形基因的表达不同。祖细胞谱系多重性在折叠的哺乳动物大脑皮层中保守。
哺乳动物基因组中结构变体的多重生成和单细胞分析
结果：在此概念证明中，我们将基因组剃须 - seq应用于小鼠胚胎干细胞和人类癌细胞，每实验产生并绘制数百至数千个SV。我们发现，通过CRE介导的对称LOXP位点产生SVS的细胞是迅速决定的，这可能是由于CRE和/或SVS本身的毒性所致。相比之下，在非对称attb/p位点，通过BXB1介导的重组产生SV的细胞是稳定的。这种稳定性使我们能够研究作用于不同类别BXB1诱导的SV的选择压力，并开始表征其功能后果。首先，我们发现带有较大缺失但没有反转的细胞是从增殖的细胞种群中预先损失的，这部分归因于不容忍中心粒损失。第二，我们观察到，尽管平衡的易位在体外耐受，不平衡的易位，尤其是那些敏感的易位，但迅速耗尽了。最后，通过在基因组洗牌细胞的瓶颈种群中共同合并转录组和盒式盒式条形码配对，我们证明我们可以确保特异性，诱导的SVS对基因表达的后果。
Transformer 碱基编辑器在哺乳动物细胞和小鼠中的设计与应用
将载脂蛋白 B mRNA 编辑酶、催化性多肽样胞苷脱氨酶与催化功能受损的 Cas 蛋白（例如 nCas9 或 dCas9）融合，提供了一种新型基因编辑技术，即碱基编辑，可高效地实现靶向碱基替换。然而，在碱基编辑中观察到全基因组和全转录组脱靶突变，这引发了对治疗应用的安全性担忧。之前，我们开发了一种新的碱基编辑系统，即 transformer 碱基编辑器 (tBE)，可在哺乳动物细胞和小鼠中诱导高效编辑，且不会观察到全基因组或全转录组脱靶突变。这里我们描述了设计和应用 tBE 的详细方案。本方案包括设计单向导 RNA (sgRNA) 和辅助 sgRNA 对、构建构建体、确定全基因组和转录组范围的脱靶突变、生产含有 tBE 的腺相关病毒、将腺相关病毒递送到小鼠体内以及检查体内编辑效果的步骤。使用 sgRNA-辅助 sgRNA 对，tBE 的高精度碱基编辑可以在 2-3 周内（在哺乳动物细胞中）或 6-8 周内（在小鼠中）完成。整个过程可以由研究人员使用分子生物学、生物信息学和小鼠饲养的标准技术共同完成。
小鼠人类遗传变异的计算建模
摘要：大脑细胞网络的信息处理能力取决于神经元及其分子和功能特征之间的物理布线模式。映射神经元并解决其单个突触连接可以通过在纳米级分辨率下以密集的细胞标记在纳米级分辨率下实现。光学显微镜独特地定位于可视化特定的分子，但是由于分辨率，对比度和体积成像能力的限制，光学显微镜的密集，突触级的电路重建已经无法触及。在这里，我们开发了基于光微镜的连接组学（LICONN）。我们将专门设计的水凝胶嵌入和扩展与基于深度学习的分割和连通性分析进行了整合，从而将分子信息直接纳入突触级脑组织重建中。liconn将允许以易于采用的方式在生物学实验中进行突触级的脑组织表型。