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结合工程化的 FnCas9 和扩展的 gRNA，实现 PAM 灵活、稳健且核碱基特异性的编辑和诊断
CRISPR 疗法的临床成功取决于 Cas 蛋白的安全性和有效性。来自新凶手弗朗西斯菌 (FnCas9) 的 Cas9 对错配底物的亲和力可以忽略不计，这使得它即使在结合水平上也能以非常高的精度区分 DNA 中的脱靶。然而，它的细胞靶向效率很低，限制了它在治疗应用中的使用。在这里，我们合理地设计了蛋白质以开发增强的 FnCas9 (enFnCas9) 变体，并将其细胞编辑活性扩展到以前无法访问的基因组位点。值得注意的是，一些变体释放了从 NGG 到 NGR/NRG 的原间隔区相邻基序 (PAM) 约束，使其在人类基因组位点上的可访问性增加了约 3.5 倍。enFnCas9 蛋白在体外和细胞中都具有单一错配特异性，从而扩大了基于 FnCas9 的 CRISPR 诊断的靶标范围，用于检测点突变和致病 DNA 特征。重要的是，它们在编辑效率、敲入率和脱靶特异性方面比其他经过设计的 SpCas9 高保真版本（SpCas9-HF1 和 eSpCas9）更胜一筹。值得注意的是，enFnCas9 变体可以与延长长度的 gRNA 结合使用，在 PAM 约束的规范碱基编辑器无法访问的位点进行强大的碱基编辑。最后，我们展示了使用 enFnCas9 腺嘌呤碱基编辑器完全纠正患者衍生的 iPSC 中的疾病特异性视网膜色素变性突变，突出了其在治疗和诊断中的广泛应用。
游离和 gRNA 结合的 FnCas9 和 SpCas9 蛋白的比较结构和动力学研究
基于 CRISPR/Cas9 的基因编辑的引入大大加速了治疗性基因组编辑。然而，CRISPR/Cas9 蛋白的脱靶 DNA 切割阻碍了其临床转化，从而阻碍了其作为可编程基因组编辑工具的广泛使用。尽管已经开发出具有更好错配识别能力的 Cas9 变体，但它们的靶向 DNA 切割率明显较低。在这里，我们将来自新凶手弗朗西斯菌 (FnCas9) 的更特异性的天然 Cas9 与最广泛使用的 SpCas9 蛋白的动力学进行了比较。对两种 Cas9 蛋白的游离形式和 gRNA 结合形式进行了长期原子 MD 模拟，并比较了它们的域重排和与 gRNA 的结合亲和力，以揭示 FnCas9 蛋白特异性增强的可能原因。与 SpCas9 相比，FnCas9 与 gRNA 的结合亲和力更大、域静电更大、波动性更大，这可以解释其特异性增强和对错配的容忍度更低。
利用 CRISPR/nCas9 对花生进行碱基编辑
花生 ( Arachis hypogaea L.) 是豆科植物的异源四倍体，能够在热带和亚热带地区生长茂盛，被认为是一种很有前途的全球油籽作物。提高油酸含量已成为花生育种的主要目标之一，因为它具有降低血液胆固醇水平等健康益处、抗氧化特性以及延长保质期等工业效益。花生基因组测序已证明存在编码脂肪酸去饱和酶 2 ( FAD2 ) 的同源基因 AhFAD2A 和 AhFAD2B，它们负责催化单不饱和油酸转化为多不饱和亚油酸。研究表明，导致 FAD2 基因移码或终止密码子的突变会导致油中油酸含量升高。在本研究中，使用与不同脱氨酶融合的 Cas9 构建了两个表达载体 pDW3873 和 pDW3876，并测试了它们作为诱导花生 AhFAD2 基因启动子和编码序列点突变的工具。两种构建体都含有单核酸酶无效变体 nCas9 D10A，PmCDA1 胞嘧啶脱氨酶与该变体融合到 C 端（pDW3873），而 rAPOBEC1 脱氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制剂 (UGI) 分别融合到 N 端和 C 端（pDW3876）。将三个 gRNA 独立克隆到两个构建体中，并在 AhFAD2 基因的三个靶位点测试其功能和效率。两种构建体都显示出碱基编辑活性，其中在靶向编辑窗口中胞嘧啶被胸腺嘧啶或其他碱基取代。 pDW3873 的效率高于 pDW3876，表明前者是花生中更好的碱基编辑器。这是一个重要的进步，因为将现有突变基因渗入优良品种可能需要长达 15 年的时间，这使得该工具对花生育种者、农民、行业以及最终对消费者都大有裨益。
