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DNA 缺口会诱发与 BRCA1 缺陷相关的突变特征
与 Brca1 +/+ 细胞相比，Brca1 m/m 细胞中的 LTGC 偏向性下降（图 2e、f 和扩展数据图 4c、d）。然而，在 RNA-DNA 杂交体中的靶链上和 nCas9-sgRNA-DNA 复合物中的非靶链上诱导的缺口之间，BRCA1 介导的 LTGC 偏向性抑制没有显著差异（扩展数据图 5a）。对于 nCas9-sgRNA，Watson 链和 Crick 链上的 PAM 之间的这种抑制也几乎没有改变（扩展数据图 5b）。总之，这些数据表明，链不对称加剧了 Brca1 缺陷引起的 nCas9 诱导的 LTGC 偏向性，这与
使用工程化的 CRISPR RNA 引导胞苷脱氨酶对结核分枝杆菌进行可编程碱基编辑
耐多药结核分枝杆菌 ( Mtb ) 感染严重危害全球人类健康，迫切需要新的治疗策略。高效的基因组编辑工具有助于识别参与细菌生理、发病机制和耐药机制的关键基因和途径，从而有助于开发耐药结核病的新疗法。在这里，我们报告了一个双质粒系统 MtbCBE，用于灭活基因并在 Mtb 中引入点突变。在该系统中，辅助质粒 pRecX-NucS E107A 表达 RecX 和 NucS E107A 以抑制 RecA 依赖性和 NucS 依赖性的 DNA 修复系统，碱基编辑质粒 pCBE 表达结合胞苷脱氨酶 APOBEC1、Cas9 切口酶 (nCas9) 和尿嘧啶 DNA 糖基化酶抑制剂 (UGI) 的融合蛋白。这两个质粒共同实现了结核分枝杆菌基因组中所需位点处 G:C 到 A:T 碱基对的有效转换。碱基编辑系统的成功开发将有助于阐明结核分枝杆菌致病机理和耐药性的分子机制，并为开发其他微生物的碱基编辑工具提供重要启发。
Transformer 碱基编辑器在哺乳动物细胞和小鼠中的设计与应用
将载脂蛋白 B mRNA 编辑酶、催化性多肽样胞苷脱氨酶与催化功能受损的 Cas 蛋白（例如 nCas9 或 dCas9）融合，提供了一种新型基因编辑技术，即碱基编辑，可高效地实现靶向碱基替换。然而，在碱基编辑中观察到全基因组和全转录组脱靶突变，这引发了对治疗应用的安全性担忧。之前，我们开发了一种新的碱基编辑系统，即 transformer 碱基编辑器 (tBE)，可在哺乳动物细胞和小鼠中诱导高效编辑，且不会观察到全基因组或全转录组脱靶突变。这里我们描述了设计和应用 tBE 的详细方案。本方案包括设计单向导 RNA (sgRNA) 和辅助 sgRNA 对、构建构建体、确定全基因组和转录组范围的脱靶突变、生产含有 tBE 的腺相关病毒、将腺相关病毒递送到小鼠体内以及检查体内编辑效果的步骤。使用 sgRNA-辅助 sgRNA 对，tBE 的高精度碱基编辑可以在 2-3 周内（在哺乳动物细胞中）或 6-8 周内（在小鼠中）完成。整个过程可以由研究人员使用分子生物学、生物信息学和小鼠饲养的标准技术共同完成。
通过恢复 GFP 活性来优化水稻、花生、鹰嘴豆和豇豆原生质体中的 Prime Editing
摘要：植物基因组的精确编辑一直是功能基因组研究和作物育种的迫切需要。Prime 编辑是一种新开发的基于 CRISPR-Cas9 的精确编辑技术，它使用工程逆转录酶 (RT)、催化受损的 Cas9 内切酶 (nCas9) 和 Prime 编辑向导 RNA (pegRNA)。此外，Prime 编辑比碱基编辑具有更广泛的编辑类型，可以产生几乎所有类型的编辑。虽然 Prime 编辑最早是在人类细胞中建立的，但它最近才被应用于植物。作为一种相对较新的技术，需要进行优化以提高不同作物的编辑效率。在本研究中，我们成功地编辑了水稻、花生、鹰嘴豆和豇豆原生质体中的突变体 GFP。在水稻中，双 pegRNA 的编辑效率比单 pegRNA 载体高出 16 倍。用双 pegRNA 载体转化花生、鹰嘴豆和豇豆后，也获得了编辑突变的 GFP 原生质体，尽管编辑效率比水稻低得多，范围从 0.2% 到 0.5%。这些初步结果有望加快在豆科植物育种计划中应用主要编辑，以加速作物改良。
具有不受束缚的逆转录酶和环状 RNA 模板的分裂引物编辑器
Es 可实现删除、插入和碱基替换而不会造成双链断裂 1 。然而，目前的 PE2、PE2* 和 PEmax 效应物（nCas9 与 Moloney 鼠白血病病毒 RT（M-MLV RT）的融合）1 – 3 > 6.3 千碱基 (kb)，超出了 AAV 的包装能力。高产量生产如此大的蛋白质或 mRNA（用于核糖核蛋白 (RNP) 或 RNA 递送）也是一项挑战。尽管一些拆分策略已用于递送 Cas9 相关基因组编辑工具 4 ，包括拆分内含肽 5 – 7 和 MS2（参考文献 8 – 10）或 SunTag 11 系链，但大多数拆分方法才刚刚开始应用于 PE 2、12、13。这些元素增加了 PE 系统的尺寸、分子复杂性以及生产和递送负担，并且限制了 PE 开发的组合吞吐量（即核酸酶和 RT 成分的混合和匹配）。pegRNA 优化对于有效的引物编辑也很重要。当前的 pegRNA 是一种结合 RNA，由 sgRNA 和包含 RT 模板 (RTT) 和引物结合位点 (PBS) 的 3′ 延伸组成。尽管在 PE 系统中整合 RNA 分子很简单，但由于 PBS 和间隔区之间不可避免的碱基配对以及潜在的 RTT-支架相互作用，它容易发生 RNA 错误折叠。最后，pegRNA 中的 3′ 末端延伸暴露在外，易受核酸酶降解，这可能会损害 pegRNA 的完整性。虽然 3′ 末端二级结构提高了 pegRNA 的稳定性 14 ，但仍需要进一步努力减少 pegRNA 的错误折叠和不稳定性。
植物における相同组换えを介した精密ゲノム编集...
CRISPR/CAS系统被发现是一种细菌免疫机制（一种驱除外毒病毒等的机制），而CRISPR/CAS9（近年来一直在世界上使用最广泛的CRISPR/CAS9）来自链球菌为增生链球菌（SPCAS9）。该系统由CAS9，一种裂解双链DNA的酶（内切酶）和一个称为“ Guide RNA（GRNA）”的短RNA分子组成。 GRNA由一个20碱基的序列互补，与位于5'端的目标序列和作为CAS9的支架的序列，当Cas9与脚手架序列结合时，形成了Cas9-grna络合物。为了使CAS9识别目标序列，需要一个称为原始的基序（PAM）的特定序列，将序列与GRNA的5'末端的20个基部互补（在SPCAS9的情况下为NGG），并且需要Cas9-guide RNA与指导rna + p Douplence rebs crement cremence extrent crement crement crements extrest rebists的互补序列的位置结合的位置。 CRISPR/CAS9系统不仅用于切割DNA，而且通过将各种效应子与Cas9蛋白相结合，而CAS9蛋白的DNA裂解活性部分或完全不足，而不需要DNA双链断裂的基因组编辑技术是一个接一个地开发的。 One of these is a technology called Prime editing, in which a fusion protein in which reverse transcriptase is linked to a Cas9 (nickase-type Cas9, nCas9) protein that has partially deficient in DNA cleavage activity and an RNA molecule in which a sequence that forms the template for reverse transcriptase is linked to the 3' end of gRNA, allowing an arbitrary modification to the target gene using RNA as a template.