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使用 CRISPR-Cas12a 对 Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 进行多重基因组工程
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可，根据 提供（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者此版本于 2022 年 8 月 23 日发布。；https://doi.org/10.1101/2022.08.22.504755 doi：bioRxiv 预印本
检查益生菌的免疫弹药机制...
参与者在四个星期内还接受了安慰剂或益生菌补充剂。益生菌补充剂（vivomixx®;visbiome®）由八种不同的细菌菌株组成：嗜热链球菌NCIMB 30438，BREVE BREVE BREVE NCIMB 30441，B. longum ncimb 30435（B. reclants as b. lallanfal as b. lycrantiss），b. incrantiss，re c. incim b. incim ncimb inc， B.乳酸），乳酸乳杆菌NCIMB 30442，L。plantarum ncimb 30437，L。paracasei ncimb 30439和L. delbrueckii subsp。保加利亚NCIMB 30440（重新分类为L. helveticus）。 每日剂量由两个小囊组成，其中包含高剂量的9000亿个菌落形成单元（CFU）/天，可以与任何冷的非碳酸饮料混合。 在对照组中，参与者收到了一个含有麦芽糖的安慰剂，没有细菌，其颜色，形状，大小，气味和味道与益生菌补充剂是无法区分的。保加利亚NCIMB 30440（重新分类为L. helveticus）。每日剂量由两个小囊组成，其中包含高剂量的9000亿个菌落形成单元（CFU）/天，可以与任何冷的非碳酸饮料混合。在对照组中，参与者收到了一个含有麦芽糖的安慰剂，没有细菌，其颜色，形状，大小，气味和味道与益生菌补充剂是无法区分的。
双质粒诱导型 CRISPR-Cas9 系统在拜氏梭菌中的改造及应用
CRISPR 技术的最新发展为改进梭菌属专用的基因组编辑工具开辟了新的可能性。在本研究中，我们改进了基于该技术的双质粒工具，以便对产生丙酮/丁醇/乙醇 (ABE) 或异丙醇/丁醇/乙醇 (IBE) 混合溶剂的两种拜氏梭菌参考菌株的基因组进行无瘢痕修饰。在 NCIMB 8052 ABE 生产菌株中，SpoIIE 孢子形成因子编码基因的失活导致孢子形成缺陷的突变体，并且通过用功能性 spoIIE 基因补充突变菌株可以恢复此表型。此外，将真菌纤维素酶编码 celA 基因插入拜氏梭菌 NCIMB 8052 染色体中，产生具有内切葡聚糖酶活性的突变体。接下来，我们采用类似的双质粒方法对天然 IBE 产生菌株 C. beijerinckii DSM 6423 的基因组进行编辑，该菌株此前从未进行过基因工程改造。首先，删除赋予甲砜霉素抗性的 catB 基因，使该菌株与我们的双质粒编辑系统兼容。作为概念验证，我们在 C. beijerinckii DSM 6423 Δ catB 中使用了我们的双质粒系统，以去除内源性 pNF2 质粒，从而大幅提高转化效率。