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一种高度特异性的 CRISPR-Cas12j 核酸酶能够使等位基因
CRISPR-Cas 系统可通过非同源末端连接 (NHEJ) 基因破坏突变等位基因来治疗常染色体显性遗传病。然而，目前的 CRISPR-Cas 系统无法将许多单核苷酸突变与野生型等位基因区分开来。在这里，我们对六种 Cas12j 核酸酶进行了功能性筛选，并确定 Cas12j-8 是一种具有超紧凑尺寸的理想基因组编辑器。Cas12j-8 表现出与 AsCas12a 和 Un1Cas12f1 相当的活性。Cas12j-8 是一种高度特异性的核酸酶，对原间隔区相邻基序 (PAM) - 近端区域中的单核苷酸错配敏感。我们通过实验证明 Cas12j-8 能够对具有单核苷酸多态性 (SNP) 的基因进行等位基因特异性破坏。Cas12j-8 识别简单的 TTN PAM，可提供高靶位点密度。计算机模拟分析显示，Cas12j-8 能够对 ClinVar 数据库中的 25,931 个临床相关变异和 dbSNP 数据库中的 485,130,147 个 SNP 进行等位基因特异性破坏。因此，Cas12j-8 特别适合用于治疗应用。
croft-seq
图1。Croft-seq的示意图。（a）具有gDNA（橙色）的链球菌Cas9的示意图，与距离dsDNA（绿色）结合，其中包含与NGG PAM序列（黄色）近端的错配（红色）。（b）Croft-Seq工作流的简化示意图。人类基因组DNA在用Cas9核酸酶消化之前用磷酸酶处理。将所得的DNA末端选择性地绑扎到生物素化衔接子上。然后除去适配器的过量，然后将连接的DNA富含磁珠富集。除去互补的非生物素化DNA链，并合成新的第二个DNA链。所得的DNA从珠子中释放出来，并通过PCR扩增进行测序。（c）Croft-seq生物信息学分析的工作流程。成对末端读数，测序和清洁残留适配器序列，首先与参考基因组保持一致。对齐的读数，该脚本使用4 bp读取窗口搜索陡峭的读取深度变化，并优先考虑潜在的脱离目标脱离靶向的读数和目标序列相似性的双向。只有靶向位置
改造 Cas12a 核酸酶变体，增强基因组编辑特异性
AU：请确认所有标题级别均正确显示：成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)-Cas12a 系统是基因编辑的强大工具；然而，crRNA-DNA 错配可能会引起不必要的切割事件，尤其是在 PAM 的远端。为了最大限度地减少这种限制，我们通过修改与靶 DNA 和 crRNA 链相互作用的氨基酸残基，设计了一种携带突变 S186A/R301A/T315A/Q1014A/K414A 的超保真 AsCas12a 变体（称为 HyperFi-As）。HyperFi-As 保留了与人类细胞中的野生型 AsCas12a (AsCas12aWT) 相当的靶向活性。我们证明 HyperFi-As 显著降低了人类细胞中的脱靶效应，并且与野生型相比，HyperFi-As 对 PAM 远端区域位置的错配容忍度明显较低。此外，采用改进的适当恒定力单分子 DNA 解拉链分析来评估 CRISPR/Cas 核糖核蛋白 (RNP) 复合物的稳定性和瞬态阶段。在 DNA-Cas12a-crRNA 复合物的解体过程中敏感地检测到了多种状态。在脱靶 DNA 底物上，与 AsCas12aWT 相比，HyperFi-As-crRNA 更难维持 R 环复合物状态，这可以准确解释为什么 HyperFi-As 在人类细胞中具有较低的脱靶效应。我们的研究结果提供了一种具有低脱靶效应的新型 AsCas12a 变体，尤其能够处理 PAM 远端区域的高脱靶。在单分子水平上，我们还揭示了 AsCas12a 变体在脱靶位点的行为方式，而用于评估 CRISPR/Cas RNP 复合物多种状态的解压缩分析可能对深入了解 CRISPR/Cas 的行为方式以及将来如何对其进行工程改造大有帮助。
使用 Cas12a 核酸酶的下一代 CRISPR 基因驱动系统
图 1. 基于 Cas12a 的基因驱动显示出受温度调节的超孟德尔遗传率。（a）CopyCat 基因驱动系统示意图。DsRed 标记的 Cas12a 是一种静态转基因，它通过等位基因转换提供复制 GFP 标记的 CopyCat 元素的核酸酶，而等位基因转换由周围的同源臂驱动。（b）表达 Cas12a 的雄性与携带黑檀木 CopyCat 构建体（e1 或 e4 基因驱动）的处女雌性杂交方案。收集的处女雌性（Cas12a-dsRed + 基因驱动-GFP）与黑檀木突变雄性杂交，通过筛选 F2 后代中的 GFP 标记来评估种系传递率。深灰色半箭头表示雄性 Y 染色体。F1 雌性中的绿色三角形表示潜在的基因驱动复制到野生型染色体上。 (c) 通过对 GFP 标记的乌木 CopyCat 构建体的 F2 后代进行表型评分，评估 F1 雌性生殖系中的基因驱动活性。遗传率测量值与平均遗传率 (%)（也以黑条表示）和进行的 F1 杂交次数 (n) 一起报告在图表顶部。
特定的弧菌核酸酶，以消除
本演示文稿（以及我们在此处可能与我们有关的任何其他陈述或信息）包含1995年《私人证券诉讼改革法》的含义中的前瞻性陈述。All statements contained in this presentation (together with any other statements or information that we may make in connection herewith) that do not relate to matters of historical fact should be considered forward-looking statements, including, without limitation, statements regarding the development of our product candidates involving our ARCUS® genome editing platform, our ARCUS-HBV nuclease and our in vivo gene editing product candidates including PBGENE-HBV and expected 2024年的里程碑。在某些情况下，您可以通过诸如“目标”，“预期”，“实现”，“相信”，“思考”，“可以”，“估算”，“期望”，“期望”，“目标”，“预期”，“五月”，“五月”，“五月”，“使命”，“任务”，“计划”，“预测”，“预测”，“优势”，“ project”，“”，“”，“”，“”或否定的词和类似的词和表达。前瞻性陈述基于管理层当前的期望，信念和假设以及当前可用的信息。
CRISPR/Cas9核酸酶在文昌鱼基因组编辑中的应用
（未经同行评审认证）是作者/资助者。保留所有权利。未经许可不得重复使用。此预印本的版权所有者此版本于 2020 年 7 月 30 日发布。；https://doi.org/10.1101/2020.07.29.227843 doi：bioRxiv preprint
特异性 ARCUS 核酸酶可消除乙肝病毒
本演示文稿包含前瞻性陈述，任何相关演示文稿也可能包含前瞻性陈述，其含义符合 1995 年《私人证券诉讼改革法》。本演示文稿和任何相关演示文稿中包含的所有与历史事实无关的陈述均应被视为前瞻性陈述，包括但不限于关于慢性乙型肝炎持久抗原消失和功能性治愈的目标、临床和监管开发以及我们平台和产品候选物的预期功效和治疗益处、ARCUS 的益处以及使用 ARCUS 的潜在扩展和开发、对我们的运营计划和业务战略的期望、实现关键里程碑和额外合作，以及对我们的流动性和为运营费用和资本支出要求提供资金的能力的期望。在某些情况下，您可以通过“目标”、“预期”、“方法”、“相信”、“考虑”、“可能”、“估计”、“期望”、“目标”、“打算”、“看起来”、“可能”、“使命”、“计划”、“可能”、“潜在”、“预测”、“项目”、“承诺”、“应该”、“目标”、“将”、“会”等术语或其否定词以及类似的词语和表达来识别前瞻性陈述。
微球菌核酸酶（MNase）用于1
2生物学系，约翰·霍普金斯大学（Johns Hopkins University），3400 N. Charles St.，235 Mudd Hall，Baltimore，MD 21218 6美国马里兰州巴尔的摩市7 8 *应向其通信。 peter.sarin@helsinki.fi， +358-2941-59533 92生物学系，约翰·霍普金斯大学（Johns Hopkins University），3400 N. Charles St.，235 Mudd Hall，Baltimore，MD 21218 6美国马里兰州巴尔的摩市7 8 *应向其通信。peter.sarin@helsinki.fi， +358-2941-59533 9
合理设计 CRISPR-Cas9 核酸酶以减弱位置依赖性脱靶效应
摘要 化脓性链球菌的 RNA 引导 Cas9 核酸酶已成为一种重要的基因编辑工具。然而，其固有的脱靶活性是生物医学应用面临的主要挑战。与一些报道的专门针对单个结构域的工程策略不同，考虑到 Cas9 的特异性是由各个结构域协同决定的，我们合理地在酶的多个结构域中引入了多个氨基酸替换，以创建潜在的高保真度变体。我们还利用了我们之前推导的活化 Cas9 复合物结构的原子模型来指导新的修饰。这种方法已鉴定出具有增强的 DNA 切割特异性的 HSC1.2 Cas9 变体。虽然 HSC1.2 变体的特异性增强在体外切割试验中似乎与位置有关，但这种 Cas9 变体的脱靶 DNA 编辑频率远低于人类细胞中的野生型 Cas9。通过分子动力学模拟研究了导致观察到的位置依赖性效应的潜在机制。我们的发现为利用结构和动态信息开发具有高基因编辑特异性的 Cas9 样酶奠定了坚实的基础。
合理设计 CRISPR-Cas9 核酸酶以减弱位置依赖性脱靶效应
摘要 化脓性链球菌的 RNA 引导 Cas9 核酸酶已成为一种重要的基因编辑工具。然而，其固有的脱靶活性是生物医学应用面临的主要挑战。与一些报道的专门针对单个结构域的工程策略不同，考虑到 Cas9 的特异性是由各个结构域协同决定的，我们合理地在酶的多个结构域中引入了多个氨基酸替换，以创建潜在的高保真度变体。我们还利用了我们之前推导的活化 Cas9 复合物结构的原子模型来指导新的修饰。这种方法已鉴定出具有增强的 DNA 切割特异性的 HSC1.2 Cas9 变体。虽然 HSC1.2 变体的特异性增强在体外切割试验中似乎与位置有关，但这种 Cas9 变体的脱靶 DNA 编辑频率远低于人类细胞中的野生型 Cas9。通过分子动力学模拟研究了导致观察到的位置依赖性效应的潜在机制。我们的发现为利用结构和动态信息开发具有高基因编辑特异性的 Cas9 样酶奠定了坚实的基础。