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使用人类 iPS 细胞和可编程核酸酶进行疾病建模和治疗原型设计 VU EMBL 的核酸酶细胞疗法实验室
使用人类 iPS 细胞和可编程核酸酶进行疾病建模和治疗原型设计 VU EMBL 基因编辑技术合作研究所的核酸酶细胞疗法实验室，Jonathan Arias（博士）首席研究员 人类 iPS 细胞和基因编辑技术的融合使我们能够访问罕见或通常无法访问的细胞类型和基因组配置，以进行疾病建模和体外治疗原型设计。在本次演讲中，我将介绍使用 CRISPR-Cas9 双等位基因编辑以确定性方式创建同源细胞模型的进展。我将讨论如何使用这种双等位基因编辑来模拟帕金森病和早发性罕见病蜡样脂褐素沉积症中的神经退行性。此外，我将展示基因编码的传感器如何实现患者分层，以及如何通过高通量和高含量系统进行化合物筛选。关于我们的实验室：我们的实验室位于立陶宛维尔纽斯。我们开发了造血细胞系（HSC 和 NK 细胞）、心室心肌细胞、神经元上皮干细胞 (NESC) 和骨骼肌中的人类细胞模型。如果您需要在人类 iPS 细胞中创建同源或报告系，请随时联系我们，我们很乐意与您合作 jonathan.arias@gmc.vu.lt https://www.gmc.vu.lt/en/group-of-cell-therapeutics/people https://www.linkedin.com/in/jonathan-arias-4116a122a/ https://orcid.org/0000-0002-3997-2355
利用 AAV5 传递的 Life Edit ® 核酸酶和引导 RNA 进行等位基因选择性 SNP 编辑，显著减少突变型 HTT 蛋白
我们的平台 Life Edit 的基因组编辑平台提供了大量且多样化的新型 RNA 引导核酸酶 (LEG)、碱基编辑器和逆转录酶编辑器，可提供灵活的编辑策略和前所未有的访问感兴趣的基因组位点的机会。我们的平台源自 AgBiome 不断增长的数万种专有非致病性微生物集合。
利用 AAV5 传递的 Life Edit ® 核酸酶和引导 RNA 进行等位基因选择性 SNP 编辑，从而显著减少突变型 HTT 蛋白
LEG-B-SGN2 靶向 'T' SNP 不影响来自健康供体的成纤维细胞系中的 wtHTT 蛋白，该成纤维细胞系为 rs362331 纯合子（C/C） LEG-B-SGN2 靶向 'T' SNP 不影响来自患者的成纤维细胞系中的 wtHTT 蛋白，该成纤维细胞系为 rs362331 杂合子（C/T），CAG 重复扩增与 'T' 等位基因同步
使用3M Harvest RC色谱澄清器
3M™Harvest RC色谱澄清仪是Solventum提供的基于电荷的澄清解决方案，用于生物制造制造业，通过替换离心液和/或深度过滤步骤来替换产物产量的增加，并简化了重组蛋白质过程的功效。5此外，已经通过行业标准平台建模显示了3M™Harvest RC色谱澄清仪，以降低销售商品成本（COGS）6。我们试图探索3M™Harvest RC色谱澄清板是否设计用于简化MAB生物处理，但可以为AAV生物处理提供类似的简化过程和成本益处。尤其是，由于细胞裂解过程中同时释放HCDNA，AAV生物处理在收集AAV颗粒方面面临重大挑战，经常将昂贵的核酸酶用于预贴上HCDNA。
PHI29 DNA聚合酶-ABO div>
成分体积底物DNA 10 - 50 ng PHI29 DNA聚合酶反应缓冲液（10x）5 µl DNTPS 0.5 mm抗性的随机六聚体引物5 µM PHI29 DNA聚合酶1 µL（10 U）noclease nuclease nuclease free H 2 O（CAT。编号mb11101）最多50 µL 2。轻轻混合和脉冲。3。在30°C下孵育90分钟。4。在65°C下使酶灭活10分钟。5。继续下游应用程序，例如pCR（用TE缓冲液稀释10-20倍，使用1-3μL稀释的DNA或DNA标记。或者，将放大的DNA存储在-20°C下。避免重复的冻结循环
CRISPR/Cas9 敲除质粒
CRISPR/Cas 系统是一种适应性免疫防御机制，古细菌和细菌利用该系统降解外来遗传物质。在这些生物体中，噬菌体的外来遗传物质被获取并整合到 CRISPR 基因座中 (1,2)。这种新物质也称为间隔物，可产生序列特异性片段，用于未来抵抗噬菌体感染。这些序列特异性片段被翻译成短 CRISPR RNA (crRNA)，并通过 CRISPR 相关 (Cas) 蛋白的核酸酶活性引导互补入侵 DNA 的切割，该蛋白也由 CRISPR 基因座编码 (1,2)。II 型 CRISPR 系统的 Cas9 核酸酶具有 RNA 结合域、α 螺旋识别叶 (REC)、包括用于 DNA 切割的 RuvC 和 HNH 的核酸酶叶以及原间隔物相邻基序 (PAM) 相互作用位点 (1,2)。 crRNA 通过与 REC 叶内的桥螺旋结合与 Cas9 核酸酶形成复合物，并与 crRNA 的骨架形成多个盐桥 (1,2,3)。
一个基因组还是数千个基因组？群体基因组学和脱靶风险
使用 SpCas9 核酸酶进行 ONE-seq 脱靶分析的结果 a，群图显示五个先前分析的 SpCas9 gRNA 的 ONE-seq 核酸酶分数。每个圆圈代表一个单独的 ONE-seq 文库成员。彩色圆圈代表先前确认的真正脱靶位点。未显示 ONE-seq 核酸酶分数低于 0.001 的位点。n/a，未在先前发表的 CIRCLE-seq 研究中进行验证。b，维恩图比较了 ONE-seq、CIRCLE-seq 和 Digenome-seq（空心彩色圆圈）提名先前由 GUIDE-seq（实心紫色圆圈）验证的真正脱靶位点的能力。所有被视为由 ONE-seq 验证的位点的 ONE-seq 核酸酶分数均 >0.01。
Salsabeel Al-Jawabreh Naemah abuhantash......
Cas9 是核酸酶（降解核酸的酶），它由 RNA 引导，可以造成单链或双链断裂，因此它与一种称为向导 RNA（g-RNA）或单向导 RNA（sg-RNA）的短单链 RNA 分子相关，这种 RNA 分子引导核酸酶到 DNA 结构中的某个序列，该序列与 RNA 序列互补。所以它是一种核糖核蛋白