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通过实时定量PCR（QPCR）筛选食品和环境表面上沙门氏菌的方案（2023年11月28日）
这种FDA开发的QPCR方法适用于使用Applied Biosystems TM（ABI）7500快速实时PCR系统快速筛选食品和环境表面。该方法靶向沙门氏菌浸润基因（INVA），该基因已被证明与s的内在化有关。哺乳动物上皮细胞中的伤寒（1-4）。该基因被发现是沙门氏菌（3,5）独有的，其DNA序列在沙门氏菌属中高度保守。（2,4,6）。该方法使用定制设计的引物和塔克曼探针来扩增具有严格特异性的沙门氏菌特异性Inva基因的262 bp片段（7,8,9），并包括定制设计的内部扩增对照（9），这是识别通常在食物中发现的PCR抑制pCR抑制的虚假结果所需的。可以在BAM第5章E9（https://www.fda.gov/media/107724/107724/download）中找到使用此QPCR方法作为沙门氏菌分离株的验证性测定的协议。在我们的两项MLV研究中，QPCR方法被证明是一种可再现，敏感和特定的快速筛选方法（11）。在MLV婴儿菠菜研究中，qPCR方法的检测极限50（LOD 50）为0.811 cfu/ 25g，用于BAM培养方法的0.837 CFU/ 25G（13）。在MLV冷冻鱼类研究中，QPCR和培养方法的LOD 50为0.75 CFU/25G。使用QPCR方法作为快速筛选工具的协议如下所述。协议中的QPCR组件和数据分析是针对ABI 7500快速实时PCR系统的。This qPCR method has been shown to be an effective and rapid screening tool for a broad range of foods that includes fruits, fresh leafy green vegetables and herbs (blackberry, blueberry, raspberry, strawberry, baby spinach, cabbage, iceberg lettuce, romaine lettuce, spring mix, basil, cilantro, parsley, dill, oregano, watercress), low-moisture foods (almond, almond butter, chia seed powder, dried cereal, dried egg noodle, infant formula, peanut butter, pine nuts, soy formula, walnuts), seafoods (fish, shrimp, raw oyster), whole shell eggs, spices (crushed red pepper, ground basil, ground black pepper, ground cumin, ground white pepper, paprika, red chili powder), and environmental surfaces (plastic, stainless钢，陶瓷瓷砖，橡胶和铸铁）以及多个动物饲料（小鸡饲料，优质苜蓿颗粒，小麦麸，整燕麦），它们是在一系列SLV研究中用浸泡或混合程序制备的（7,8,9,10）。必须首先根据FDA微生物学方法验证指南（https://wwwww.fda.gov/media/83812/download）或其他国际认可的验证指南，例如AOAC International的Appendix j（httpp：htttp：htttp：/JAPF：标准化组织的16140：2 2016（www.iso.org）。
选择和验证内部控制基因在不同条件下的定量实时RT = Phelebopus pententosus基因表达的QPCR归一化
phlebopus ententosus（berk。和broome）Boedijn是一种有吸引力的食用蘑菇，被认为是实现人工栽培的唯一bolete。基因表达分析已广泛用于可食用真菌的研究中，对于阐明与复杂生物学过程有关的基因的功能很重要。选择适当的参考基因对于确保可靠的RT – QPCR基因表达分析至关重要。在我们的研究中，从25个传统家政基因中选择了12个候选对照基因，这些基因基于其表达稳定性在3个发育阶段的9个转录组中。在不同条件和发育阶段，使用Genorm，Normfinder和Reffinder进一步评估了这些基因。结果表明，含MSF1结构域的蛋白（MSF1），突触动蛋白（SYB），有丝分裂原激活的促蛋白激酶基因（MAPK），TATA结合蛋白1（TBP1）（TBP1）和Spry ronain Protin（SPRY）是所有样品的参考基因，而El ef ef ef ef ef efta和ef的最稳定。泛素结合酶（UBCE）是最不稳定的。基于转录组结果选择了基因SYB，并被鉴定为p中的新参考基因。pententosus。这是关于这种真菌中参考基因的鉴定的首次详细研究，可以为选择基因和量化基因表达提供新的见解。
开发和验证核酸生物标志物 qPCR 方法作为药物开发工具：需要考虑的要点
1 日本国立卫生科学研究所药物安全科学部，神奈川 210-9501，日本 2 新日本生物医学实验室有限公司，鹿儿岛 891-1394，日本 3 协和麒麟株式会社，静冈 411-8731，日本 4 武田药品工业株式会社，神奈川 251-8555，日本 5 CMIC Pharma Science 有限公司，山梨 408-0044，日本 6 三菱田边制药株式会社，神奈川 251-8555，日本 7 礼来日本株式会社，兵库县 651-0086，日本 8 日本药品制造商协会药物评估委员会临床评估小组委员会，东京 103-0023，日本 9 ASKA 制药株式会社日本神奈川县，251-8555 10 Taiho Pharmaceutical Co., Ltd，茨城县，300-2611，日本 11 Nippon Shinyaku Co., Ltd，京都，601-8550，日本 12 Daiichi Sankyo Co., Ltd，东京，140-8710，日本 *通讯作者：电话：+81 44 270 6623; yoshiro@nihs.go.jp
我选择您：在拟南芥中生殖组织中选择准确的参考基因
摘要：定量实时聚合酶链反应（QPCR）是一种广泛使用的方法，用于分析生殖组织中的基因表达模式以及在突变背景中检测基因水平。该技术需要稳定的参考基因才能使靶基因的表达水平归一化。尽管如此，大量出版物继续呈现QPCR结果，该结果标准化为单个参考基因，据我们所知，在拟南芥的特定生殖组织中未对多个参考基因进行比较评估。在此，我们在两个条件套装中评估了十个候选参考基因（UBC9，ACT7，GAPC-2，RCE1，PP2AA3，TUAA2，SAC52，SAC52，SAC52，SAC52，SAC52和His 3.3）的表达稳定水平：在两个条件套件中：一个集合：一个集合：一个跨度开发以及使用不同的基因类别的型型型。使用Reffinder工具进行了稳定性分析，该工具结合了四种统计算法（Genorm，Normfinder，Best Keepere和比较∆ CT方法）。我们的结果表明，RCE1，SAC52和TUA2在不同的发育阶段具有最稳定的表达，而YLS8，His3.3和ACT7是突变研究中归一化的最高级别参考基因。此外，我们通过分析与繁殖有关的基因的表达模式验证了我们的结果，并检查了在已发表的突变背景中这些基因的表达。总体而言，我们为塔利亚纳曲霉的生殖组织提供了适当的参考基因库，这将在这种情况下促进进一步的基因表达研究。更重要的是，我们提出了一个框架，该框架将促进对任何科学领域中基因表达的一致，准确的分析。同时，我们强调了明确定义的相关性，并描述了与qPCR相关的实验条件，以提高科学可重复性。
qPCR 或 dPCR：选择适合您的研究需求的解决方案
定量 PCR (qPCR) 和数字 PCR (dPCR) 用于定量生物样本中的特定核酸。这两种技术都适用于许多应用，但在从通量到灵敏度等许多方面存在差异。那么，哪种方法更适合您的实验室应用呢？
受监管的生物分析实验室中 qPCR 和 dPCR 验证的最佳实践
摘要。随着基因和细胞治疗产品数量的不断增加，分子技术在生物分析实验室中的应用也变得越来越普遍。目前，这些技术尚无生物分析监管指南，合同研究组织依赖科学判断和最佳实践来执行这项工作，以符合 GxP 要求，用于支持生物分布和载体脱落的临床前和临床研究。本文介绍了定量聚合酶链反应 (qPCR) 和数字 PCR (dPCR) 检测的开发和验证过程和原理，如 2021 年 AAPS 为期两天的 qPCR 协调研讨会上所述。本文的范围包括利用这些技术的生物分析验证参数和验收标准。此外，本文还将重点介绍这些分子技术的优缺点，并说明应避免的常见陷阱。本文旨在提供最佳实践、工作建议和促进未来的监管指导。
Sciencell的绝对大鼠线粒体DNA拷贝数定量QPCR测定套件（ARMQ）旨在直接比较平均MTDNA副本NUM
Sciencell的绝对大鼠线粒体DNA拷贝数定量QPCR测定试剂盒（ARMQ）旨在直接比较样品的平均mtDNA拷贝数。大鼠mtDNA底漆集识别并放大了大鼠mtDNA上最保守的区域之一，并且不会放大核基因组DNA上的任何脱靶序列。单复制参考（SCR）引物集识别并放大了大鼠染色体17的100 bp长区域，并用作数据归一化的参考。具有已知mtDNA拷贝数的参考基因组DNA样品是计算目标样品的mtDNA拷贝数的参考。精心设计的底漆可确保：（i）值得信赖的量化效率高； （ii）没有非特异性扩增。通过QPCR验证了每个底漆集，并通过熔融曲线分析和凝胶电泳进行了扩增特异性，并通过模板系列稀释来验证。2倍Goldnstart Taqgreen QPCR Master Mix（CAT＃MB6018A-1）是SYBR®基于绿色染料的QPCR主混合物，具有“热启动”属性。它包含单个管中的SYBR®绿色，DNTP，TAQ DNA聚合酶和惰性金色载荷指示器。通过Sciencell独特的化学化学TAQ DNA聚合酶实现的“热启动”特性提供了对引物二聚体形成的最大抑制作用。高级缓冲仪公式提供了较高的特异性和效率，并具有较宽的线性动态范围。惰性金色加载指示器允许在QPCR板或试管中更好地可视化和跟踪样品加载。
ScienCell 绝对大鼠线粒体 DNA 拷贝数定量 qPCR 检测试剂盒 (ARMQ) 旨在直接比较平均 mtDNA 拷贝数
ScienCell 绝对大鼠线粒体 DNA 拷贝数定量 qPCR 检测试剂盒 (ARMQ) 旨在直接比较样本的平均 mtDNA 拷贝数。大鼠 mtDNA 引物组可识别并扩增大鼠 mtDNA 上最保守的区域之一，并且不会扩增核基因组 DNA 上的任何脱靶序列。单拷贝参考 (SCR) 引物组可识别并扩增大鼠 17 号染色体上 100 bp 长的区域，并作为数据标准化的参考。已知 mtDNA 拷贝数的参考基因组 DNA 样本可作为计算目标样本 mtDNA 拷贝数的参考。精心设计的引物确保：(i) 高效，实现可靠的定量；(ii) 无非特异性扩增。每个引物组都已通过 qPCR 验证，包括熔解曲线分析和凝胶电泳，以确保扩增特异性，并通过模板连续稀释来验证扩增效率。 2X GoldNStart TaqGreen qPCR Master Mix（目录号：MB6018a-1）是一种基于 SYBR ® Green 染料的 qPCR Master Mix，具有“热启动”特性。它在单个试管中包含 SYBR ® Green、dNTP、Taq DNA 聚合酶和惰性金色上样指示剂。通过 ScienCell 独特的化学修饰 Taq DNA 聚合酶实现的“热启动”特性可最大程度地抑制引物二聚体的形成。先进的缓冲液配方具有出色的特异性和效率，线性动态范围宽。惰性金色上样指示剂可更好地可视化和跟踪 qPCR 板或试管中的样品上样情况。
ScienCell 绝对大鼠线粒体 DNA 拷贝数定量 qPCR 检测试剂盒 (ARMQ) 旨在直接比较平均 mtDNA 拷贝数
ScienCell 绝对大鼠线粒体 DNA 拷贝数定量 qPCR 检测试剂盒 (ARMQ) 旨在直接比较样本的平均 mtDNA 拷贝数。大鼠 mtDNA 引物组可识别并扩增大鼠 mtDNA 上最保守的区域之一，并且不会扩增核基因组 DNA 上的任何脱靶序列。单拷贝参考 (SCR) 引物组可识别并扩增大鼠 17 号染色体上 100 bp 长的区域，并作为数据标准化的参考。已知 mtDNA 拷贝数的参考基因组 DNA 样本可作为计算目标样本 mtDNA 拷贝数的参考。精心设计的引物确保：(i) 高效，实现可靠的定量；(ii) 无非特异性扩增。每个引物组都已通过 qPCR 验证，包括熔解曲线分析和凝胶电泳，以确保扩增特异性，并通过模板连续稀释来验证扩增效率。 2X GoldNStart TaqGreen qPCR Master Mix（目录号：MB6018a-1）是一种基于 SYBR ® Green 染料的 qPCR Master Mix，具有“热启动”特性。它在单个试管中包含 SYBR ® Green、dNTP、Taq DNA 聚合酶和惰性金色上样指示剂。通过 ScienCell 独特的化学修饰 Taq DNA 聚合酶实现的“热启动”特性可最大程度地抑制引物二聚体的形成。先进的缓冲液配方具有出色的特异性和效率，线性动态范围宽。惰性金色上样指示剂可更好地可视化和跟踪 qPCR 板或试管中的样品上样情况。
qpcrbio探针混合Lo-rox
底漆设计：对于在快速循环条件下有效扩增，我们建议在80bp和200bp之间的扩增子长度。与所有制造商主人混合了较短的扩增子长度，反应可以循环越快。放大长度不得超过400bp。引物应使用默认引物3设置（https://bioinfo.ut.ee/primer3/）的预测熔点约为60°C。对于Taqman®探针，选择接近5'底漆的探针，避免终末鸟苷残基。对于Taqman®探针，选择接近5'底漆的探针，避免终末鸟苷残基。