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提供基因组编辑试剂：RNP 还是质粒？ - NET
当该技术首次被发现时，需要构建质粒载体来表达 Cas 酶和 gRNA，因为长合成 RNA 非常昂贵且不广泛可用。转染的质粒将利用细胞的转录和翻译机制来产生 Cas 蛋白和 gRNA。然而，现在大量数据表明这种方法效率低下，并且会产生很高的脱靶效应。将 Cas 蛋白和 gRNA 作为核糖核蛋白 (RNP) 复合物递送是一种有效且经过验证的方法，与质粒表达载体相比具有多种优势。
![b'genation 的 C3 和 C2 位尚未开发。在此，我们报道了一种无催化剂获取 1-芳基 2,3-二碘咔唑 [7,8] 的方法，其中涉及碘转位（方案 1D）。值得注意的是，我们的方案允许在三个连续位置 [9] 即 C1、C2 和 C3 对咔唑核心进行可控官能化。环化前体 (碘吲哚基)炔醇 1a \xe2\x80\x93 n 是使用已知程序由适当的吲哚-2-甲醛制备的。[5] 我们的旅程始于研究苯基取代炔醇 1a 作为模型底物的反应（表 1）。 [10] 我们研究了 1a 与几种碘化试剂（如 I 2 、NIS、ICl 和 Ipy 2 BF 4 ）的反应。在碳酸钠存在下，在异丙醇中，在 15 °C 下使用 ICl [11] 可有效实现串联碘环化-碘移位。使用 1.1 倍过量的 ICl 可得到三环 2a ，产率为 50%（表 1，条目 5），而使用 2.5 倍过量的 ICl 可得到所需的杂环，产率为 60%（表 1，条目 3）。通过对粗反应混合物进行 TLC 和 1 H NMR 分析观察到总转化率，未检测到副产物或聚合反应。然而，在柱层析纯化 2,3-二碘-咔唑 2a 的过程中观察到一些分解，这可能是导致分离产率适中的原因。值得注意的是，重排的 1-苯基-2,3-二碘-咔唑 2a 是唯一的区域异构体。使用有机碱代替 K 2 CO 3 或不同的溶剂'](/simg/8/855f3c9598aa8a034e402cab16971aa1920b4ee4.webp)
b'genation 的 C3 和 C2 位尚未开发。在此，我们报道了一种无催化剂获取 1-芳基 2,3-二碘咔唑 [7,8] 的方法，其中涉及碘转位（方案 1D）。值得注意的是，我们的方案允许在三个连续位置 [9] 即 C1、C2 和 C3 对咔唑核心进行可控官能化。环化前体 (碘吲哚基)炔醇 1a \xe2\x80\x93 n 是使用已知程序由适当的吲哚-2-甲醛制备的。[5] 我们的旅程始于研究苯基取代炔醇 1a 作为模型底物的反应（表 1）。 [10] 我们研究了 1a 与几种碘化试剂（如 I 2 、NIS、ICl 和 Ipy 2 BF 4 ）的反应。在碳酸钠存在下，在异丙醇中，在 15 °C 下使用 ICl [11] 可有效实现串联碘环化-碘移位。使用 1.1 倍过量的 ICl 可得到三环 2a ，产率为 50%（表 1，条目 5），而使用 2.5 倍过量的 ICl 可得到所需的杂环，产率为 60%（表 1，条目 3）。通过对粗反应混合物进行 TLC 和 1 H NMR 分析观察到总转化率，未检测到副产物或聚合反应。然而，在柱层析纯化 2,3-二碘-咔唑 2a 的过程中观察到一些分解，这可能是导致分离产率适中的原因。值得注意的是，重排的 1-苯基-2,3-二碘-咔唑 2a 是唯一的区域异构体。使用有机碱代替 K 2 CO 3 或不同的溶剂'
b'genation 的 C3 和 C2 位尚未开发。在此，我们报道了一种无催化剂获取 1-芳基 2,3-二碘咔唑 [7,8] 的方法，其中涉及碘转位（方案 1D）。值得注意的是，我们的方案允许在三个连续位置 [9] 即 C1、C2 和 C3 对咔唑核心进行可控官能化。环化前体 (碘吲哚基)炔醇 1a \xe2\x80\x93 n 是使用已知程序由适当的吲哚-2-甲醛制备的。[5] 我们的旅程始于研究苯基取代炔醇 1a 作为模型底物的反应（表 1）。 [10] 我们研究了 1a 与几种碘化试剂（如 I 2 、NIS、ICl 和 Ipy 2 BF 4 ）的反应。在碳酸钠存在下，在异丙醇中，在 15 °C 下使用 ICl [11] 可有效实现串联碘环化-碘移位。使用 1.1 倍过量的 ICl 可得到三环 2a ，产率为 50%（表 1，条目 5），而使用 2.5 倍过量的 ICl 可得到所需的杂环，产率为 60%（表 1，条目 3）。通过对粗反应混合物进行 TLC 和 1 H NMR 分析观察到总转化率，未检测到副产物或聚合反应。然而，在柱层析纯化 2,3-二碘-咔唑 2a 的过程中观察到一些分解，这可能是导致分离产率适中的原因。值得注意的是，重排的 1-苯基-2,3-二碘-咔唑 2a 是唯一的区域异构体。使用有机碱代替 K 2 CO 3 或不同的溶剂'
微生物生物技术确保国家重要资源供应安全：能源、食品和水、医疗试剂、废物处理和循环经济
不必要的物流基础设施和额外的监管监督。政府可以而且必须通过最大限度地提高自身生产率，最大限度地减少对基本资源的不安全性，从而减少对其他资源的依赖。能源、食品、医疗产品等供应都是如此。这不是完全自给自足/完全独立于外部供应的问题，这显然对大多数国家的大部分基本资源来说是不可能的；这是一个通过尽可能减少依赖、激发当地创造力和发挥自身潜力来最大限度地减少问题的问题。是的：这至少在最初会涉及经济成本，但应对当前的能源危机和迫在眉睫的粮食危机也有经济成本，这种成本可能在未来任何时候重复出现。而且，正如我们所知，随着专业知识和制造效率的提高，成本会下降。此外，我们也知道，现有价格取决于供求关系，因此也会随着时间的推移而变化，有时是不可预测的。虽然必须让不同的参与者和战略参与创建政治、经济、技术和后勤框架，以通过最大限度地减少对他人对基本资源的依赖来最大限度地保障国家安全，但至关重要的是要超越现在可能的范围，战略性地投资未来。微生物学和微生物生物技术在改善基本资源的供应安全方面发挥着关键作用（Timmis 等人，2017 年；另见《微生物生物技术》特刊《微生物生物技术对可持续发展目标的贡献》：https://sfamjournals.onlinelibrary.wiley.com/toc/17517915/2017/10/5）。其中一些作用可以立即得到比现在更有效的利用，而另一些作用则需要进一步开发，包括但不限于以下资源领域的应用：
病毒作为递送基因编辑试剂的向量
病毒是核酸的天然载体，DNA和RNA植物病毒均已设计为延伸或替换常规向量以递送基因编辑试剂。本章回顾了工程向量所必需的病毒生物学的各个方面，突出显示了使用病毒来克服基因编辑中传统限制的地标研究，并概述了在新系统或新目标中使用病毒载体的重要考虑因素。是由其感染模式和效用作为向量，DNA和RNA病毒的基本差异的动机。DNA病毒被评估为通过同源性定向修复（HDR）进行有效基因编辑的复制载体。本章将RNA病毒作为基因编辑试剂递送的移动向量进行了评论。本章包括关键案例研究以及研究的未来趋势。
合成 CRISPR/Cas9 试剂促进基因组编辑...
CRISPR/Cas9 已成为斑马鱼基因组编辑的有力工具，它允许使用 DNA 模板和同源定向修复 (HDR) 快速产生功能丧失突变和特定等位基因的敲入。我们检查了合成的、化学修饰的 gRNA 的效率，并证明与重组 Cas9 蛋白结合可诱导插入缺失和大型基因组缺失。我们开发了一种体内遗传检测方法来测量 HDR 效率，并利用该检测方法来测试改变模板设计对 HDR 的影响。利用合成的 gRNA 和线性 dsDNA 模板，我们成功地在多个基因组位点进行了荧光团的敲入，并证明了以高效率通过种系传递。我们证明合成的 HDR 模板可用于敲入细菌硝基还原酶 (ntr)，以促进特定细胞类型的谱系消融。总的来说，我们的数据证明了结合合成 gRNA 和 dsDNA 模板在体内进行同源定向修复和基因组编辑的实用性。
使用 CRISPR 试剂对人类 B 细胞系进行电穿孔
图 1. 最佳条件基于细胞存活率和靶向敲除率。根据上述方案，每次电穿孔用含有靶向人 CD19 的 crRNA 的 RNP（从针对不同 B 细胞系中细胞内和细胞外标志物的 30 多种 crRNA 筛选中选择）转染 100 万个 Ramos 细胞。（A）电穿孔后的第二天，用 2.5 μg/mL 碘化丙啶（BioLegend，产品目录号 421301）对部分细胞染色，并通过流式细胞术进行分析。（B）电穿孔五天后，用 2.5 μg/mL Alexa Fluor ® 647 抗人 CD19（BioLegend，产品目录号 302220，克隆 HIB19）加碘化丙啶对部分细胞染色，并通过流式细胞术进行分析。对照 = 未经电穿孔的细胞：RNP 混合物。数据由德国弗莱堡大学的 Marco Cavallari 博士提供。
使用 ESCORT 试剂将 Bacmid DNA 转染到 SF9 细胞中
*此程序专门适用于转染源自 Bac-to-Bac 系统 (Invitrogen) 的杆粒 DNA。我们使用的杆粒 DNA 通常使用标准小量制备程序生成，如 Bac-to-Bac 用户手册中所述。我们发现使用商用小量制备试剂盒或柱子没有好处。
无碱性地点化学裂解的新试剂
热哌啶通常用于在损伤部位裂解无碱性和紫外线辐射的DNA。它可能对DNA造成非特异性损害，这可能是因为它是一个强大的基础，并且会产生大量浓度的羟基离子，这些羟基离子可以攻击嘌呤和雌性。我们表明，其他几个胺可以在中性pH或接近中性pH下切割无碱性DNA而不会造成非特异性损害。一个二氨酸，n，n-二甲基乙二胺，根据温度有效地通过i8-或i，8- ellations pH 7.4的pH NNA裂解。使用最终标记的寡核苷酸，我们表明裂解主要是基于消除反应的，但是4'，5'-周期化也很重要。该试剂还以UVC和UVB诱导的光产物裂解，产生与哌啶相同的总体模式，但没有非特异性损害。在DNA中定位低水平的光产物（例如由天然阳光引起的含量）中应该很有价值。