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World File Search Systemrhizogenes
新的整合载体可增加农杆菌的转化并有助于表征大豆 GmTML 基因家族成员的作用
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可，根据 提供（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者此版本于 2024 年 7 月 26 日发布。；https://doi.org/10.1101/2024.07.25.605222 doi：bioRxiv 预印本
优化农杆菌介导的大豆毛状根体外和体外转化，以便使用可视化方法筛选转化子
体外和体外农杆菌介导的毛状根转化 (HRT) 测定是植物生物技术和功能基因组学工具包的关键组成部分。在本报告中，使用 RUBY 报告基因优化了大豆的体外和体外 HRT。评估了不同的参数，包括农杆菌菌株、细菌细胞培养物的光密度 (OD 600 )、共培养基、大豆基因型、外植体年龄以及乙酰丁香酮的添加和浓度。总体而言，就毛状根和转化根（表达 RUBY ）的诱导百分比而言，体外测定比体外测定更有效。尽管如此，体外技术被认为更快且方法更简单。在 cv 的 7 天大子叶上观察到了 RUBY 的最高转化。 Bert 用 R1000 接种 30 分钟，R1000 悬浮在 ¼ B5 培养基中，OD 为 600 (0.3)，乙酰丁香酮含量为 150 µM。该测定的参数还通过两步体外毛状根转化获得了最高百分比的 RUBY。最后，使用基于机器学习的建模，进一步确定了两种测定的最佳方案。本研究建立了适用于大豆功能研究的高效可靠的毛状根转化方案。
优化基因修饰 - 葡萄杆菌 -
电穿孔已成为一种高效的方法，可以快速，熟练地将外源质粒DNA引入各种细胞类型，尤其是那些缺乏自然能力的细胞类型。本协议文章描述了一种使用电穿孔转化农杆菌Rhizogenes K599的方法。这种方法虽然需要纯化的质粒DNA，有能力的细菌以及标准的电穿孔设备，例如基因脉冲控制器和比色杯，但就转化效率和速度而言具有显着优势。本文详细介绍的协议不仅概述了程序步骤，还强调了在A. rhizogenes K599研究的背景下有效转化的重要性。此外，它提供了有关所达到的转化率的见解，从而为研究人员提供了评估该方法疗效的基准。通过阐明设备要求和程序上的细微差别，该协议旨在使研究人员能够采用电穿孔作为A. rhizogenes k599遗传操作的可靠工具，从而促进各种生物技术应用中的进步。
J. A MER . S OC . H ORT . S CI . 148(6):266 – 275. 2023. https://doi.org/10.21273/JASHS05311-23 CRISPR/Cas9 介导的菊粉双靶向诱变
摘要 。橡胶蒲公英 ( Taraxacum kok-saghyz ) 是一种天然产橡胶的蒲公英，具有成为工业作物的潜力。菊粉是橡胶蒲公英中的储存碳水化合物，其合成与橡胶生产竞争同化碳。我们使用成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关蛋白 (Cas) 系统同时靶向编码 1-果聚糖的基因中的两个位点：果聚糖-1-果糖基转移酶基因 (1-FFT)，这是菊粉生物合成中的关键酶。使用发根农杆菌和根癌农杆菌介导的植物转化方法产生具有 CRISPR/Cas9 元件的转基因植物。通过 A 的转化率分别为 71% 和 64%。 rhizogenes 和 A. tumefaciens 介导的转化分别对转基因橡胶蒲公英和根癌农杆菌介导的转化进行了研究。通过限制性位点丢失法和桑格测序证实了诱变。在通过 A. rhizogenes 获得的 13 株转基因植物中，有 6 株显示 1-FFT 基因内的两个靶位点均进行了编辑。使用 A. rhizogenes 介导的转化在 10 周内获得了转基因橡胶蒲公英植物，这比 A. tumafaciens 转化子所需的 6 个月要快得多。在通过 A. tumefaciens 获得的 11 株转基因植物中，有 5 株在两个靶位点都发生了突变。逆转录聚合酶链式反应证实了所有编辑转化子中 Cas9 的表达。A. rhizogenes 介导的双突变转化子和 A. tumefaciens 介导的双突变转化子的菊粉含量都低于野生型植物。此外，A. rhizogenes 介导的转化体的橡胶含量高于野生型植物。因此，本研究验证了使用 CRISPR/Cas9 基因编辑作为橡胶蒲公英中产生有用突变的有效工具，并且可以在未来的作物改良方法中实施。
密歇根州立大学
图：图1。PMSU2DR-02 T-DNA的线性图。 图2。 A。农杆菌根源菌株Arport1中PMSU2DR-02的圆形图。 B. tumefasciens菌株ATJGT105中PMSU2DR-02的圆形图。 图3。 PMSU2DR-02 T-DNA插入物的序列。 表列表：表1。 基因供体生物的分类分类表2。 pMSU2DR-02缩写和定义的DNA插入物的遗传元素：ARPORT1：含有gaantry基因在毒力质粒中堆叠所需的遗传成分的根状腺根源菌株。 直接用于植物转化。 cc-nb-lrr：N末端盘绕圈（CC）结构域，核苷酸结合位点（NB）和富含亮氨酸的重复序列（LRRS）EHA105：EHA105 tumefaciens菌株对土豆和其他植物的转基因作用有用。 gaantry：使用重组酶技术HS中的核酸转移基因组装HS：高度敏感的反应JGT105：Tumefaciens JGT105 Gaantry菌株，该菌株是tumefaciens eha105的衍生物，含有基因组成的群体。 直接用于植物转化。 LB: Left Border MOA: Mechanism of Action MSU: Michigan State University NCBI: National Center for Biotechnology Information NPTII: Neomycin phosphotransferase II ONT: Oxford Nanopore Technology ORF: Open Reading Frame PCR: Polymerase Chain Reaction PLRV: Potato Leaf Roll Virus PVY: Potato Virus Y R genes: Resistance genes RB: Right Border RSR: Regulatory Status Review T-DNA：转移DNAPMSU2DR-02 T-DNA的线性图。图2。A。农杆菌根源菌株Arport1中PMSU2DR-02的圆形图。B. tumefasciens菌株ATJGT105中PMSU2DR-02的圆形图。图3。PMSU2DR-02 T-DNA插入物的序列。表列表：表1。基因供体生物的分类分类表2。pMSU2DR-02缩写和定义的DNA插入物的遗传元素：ARPORT1：含有gaantry基因在毒力质粒中堆叠所需的遗传成分的根状腺根源菌株。直接用于植物转化。cc-nb-lrr：N末端盘绕圈（CC）结构域，核苷酸结合位点（NB）和富含亮氨酸的重复序列（LRRS）EHA105：EHA105 tumefaciens菌株对土豆和其他植物的转基因作用有用。gaantry：使用重组酶技术HS中的核酸转移基因组装HS：高度敏感的反应JGT105：Tumefaciens JGT105 Gaantry菌株，该菌株是tumefaciens eha105的衍生物，含有基因组成的群体。直接用于植物转化。LB: Left Border MOA: Mechanism of Action MSU: Michigan State University NCBI: National Center for Biotechnology Information NPTII: Neomycin phosphotransferase II ONT: Oxford Nanopore Technology ORF: Open Reading Frame PCR: Polymerase Chain Reaction PLRV: Potato Leaf Roll Virus PVY: Potato Virus Y R genes: Resistance genes RB: Right Border RSR: Regulatory Status Review T-DNA：转移DNA
召唤植物释放的通知...
烟草变换。 div>生成转基因线T0。 div>该试验的烟草线对象是由K326商业品种的烟草植物的CRISPR/CAS9技术产生的。 div>为此，由烟草植物的农杆菌根源介导的，具有相应的转化载体，其中包含DSRED和NPTII蛋白的转录单位（选择标记物）（选择标记），CAS9蛋白的转录单位，以及用于辅助辅助的转录单元的转录单位，以辅助构图。 div>
6这些作者同等贡献 *通信：zhujk@sustech.edu.cn（J.-K.Z。）收到：2023年9月27日；接受：2023年11月3日；发布
遗传转化是一个复杂且资源密集型的过程，它是产生GMO（转基因生物）或基因编辑作物的关键瓶颈。1许多研究人员探索了激素和植物发育调节基因来增强植物再生，从而提高了组织培养依赖性遗传转化的效率。2先前，我们开发了无组织培养的“切割浸入”（CDB）方法来进行遗传转化，利用农杆菌根源基因根源诱导和转化来自外植体切割部位的毛根。3遗传转化的植物是从具有芽形成能力的转化的毛根中生长的。CDB方法极大地简化了遗传转化和基因编辑（包括Taraxacum Kok-Saghyz Rodin（TKS））的实验工作流程。在这里，我们通过省略了毛茸茸的根形成过程，在CDB方法中开发了一个极为简化的过程，从而大大节省了人工和时间。
1 2 蒺藜苜蓿根瘤的定向诱变——...
1 2使用农业杆菌的诱变特异性半胱氨酸（NCR）基因3植物生物学，生物学研究中心，EötvösLóránd研究网络，匈牙利12 SZEGED，匈牙利13 2遗传学和生物技术研究所，匈牙利农业与生命大学14科学14科学，匈牙利15 16 17 16 17 16 17 18 19 20 20 20 21 21 22 22 23 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 25 2 25 29 * bg and jb and jud撰写。 30 31 通讯作者：Péter Kaló，电子邮箱：kalo.peter@brc.hu 32 33 ORCID ID： 34 35 Peter Kalo：0000-0002-0404-8904 36 Berivan Güngör：0000-0002-5612-1130 37 János Barnabás Biró：0000-0001-8851-0387 38 Agota Domonkos：0000-0003-4017-0605 39 Beatrix Horvath：0000-0001-8499-568X 40 41 42 43
从 CRISPR/Cas9 介导的胡萝卜 (Daucus carota subsp. sativus) 着丝粒组蛋白 H3 (CENH3) 基因编辑中获得的见解
单倍体的产生是加速植物育种过程的最有效手段之一。在大多数作物物种中，有效的单倍体技术尚未出现或仅适用于有限的一组基因型。最近发表的关于拟南芥和玉米、小麦等主要谷类作物通过 CRISPR/Cas9 介导的着丝粒组蛋白 H3 基因 (CENH3) 编辑成功诱导单倍体的研究结果表明，这种生产单倍体植物的新方法也可能适用于胡萝卜等蔬菜物种。在这里，我们报告并总结了过去几年专注于基于 CRISPR/Cas9 编辑胡萝卜 CENH3 基因的不同实验和遗传方法。我们还描述了在胡萝卜基因组中发现的第二个 CENH3 基因位点，这使生成和分析假定的单倍体诱导基因型的尝试变得复杂。我们表明，三种不同的 CRISPR/Cas9 靶构建体（单独使用或组合使用）可以成功靶向胡萝卜 CENH3。已经发现了有希望的突变体，例如同框插入/缺失或同框删除突变体，但它们是否能成功用作假定的单倍体诱导物尚不确定。跨越 CRISPR 靶位点的扩增子的下一代测序和基于转录本的扩增子测序似乎是选择有希望的突变体、估计突变频率和首次预测涉及哪个基因的合适方法。本研究的另一个目的是用外来 CENH3 基因同时敲除和补充内源胡萝卜 CENH3 基因。利用根瘤菌将基于 CRISPR/Cas9 的胡萝卜 CENH3 敲除构建体与从人参 (Panax ginseng) 克隆的 CENH3 基因共转化。结果表明，人参 CENH3 蛋白在胡萝卜染色体的着丝粒区域内积累，表明 PgCENH3 可能是这种方法的合适候选者。然而，目前尚不清楚该基因是否在减数分裂细胞分裂过程中充分发挥作用并能够补充致死配子。本文讨论了开发基于 CENH3 的胡萝卜 HI 系统的挑战和未来前景。
简单、高效、开源的 CRISPR/Cas9 策略用于欧洲山杨多位点基因组编辑
尽管 CRISPR/Cas9 系统已成功用于作物育种，但其在林木中的应用仍然有限。本文，我们描述了一种基于 Golden Gate MoClo 克隆的杂交杨树（Populus tremula × alba INRA 克隆 717-1B4）的有效基因编辑策略。为了测试系统生成单基因突变体的效率，设计了两个单向导 RNA (sgRNA)，并将其与 Cas9 表达盒一起整合到 MoClo Tool Kit 2 级二元载体中，以突变 SHORT ROOT (SHR) 基因。此外，我们还通过表达一个针对 YUC4 基因单个位点的 sgRNA 和另一个针对 PLT1 基因的 sgRNA 来测试其同时在两个基因中引入突变的效率。为了对该方法进行稳健评估，我们重复了该策略，使用独立的构建体同时靶向 LBD12 和 LBD4 基因。我们通过农杆菌介导的叶片转化产生了毛状根。测序结果证实了 PtaSHR 靶位点发生了 CRISPR/Cas9 介导的突变。检测到了双等位基因和纯合敲除突变。跨越两个靶位点的缺失和小插入/缺失是最常见的突变。在测序的 22 个 SHR 等位基因中，有 21 个发生了突变。表型表征表明，具有 SHR 基因双等位基因突变的转基因根缺乏明确的内胚层单细胞层，表明其基因功能保守，类似于拟南芥 Arabidopsis thaliana (L.) Heynh 中的同源物。测序结果还揭示了该系统产生双突变体的高效性。在评估的四个转基因根中，有三个 ( yuc4/plt1 ) 和两个 ( lbd12/lbd4 ) 检测到了 yuc4/plt1 和 lbd12/lbd4 根中两个基因的双等位基因突变。最常见的突变是单个靶位点的小片段缺失或单个核苷酸插入。这种 CRISPR/Cas9 策略是一种快速、简单且标准化的基因编辑工具，可用于评估基因在杨树根部径向细胞分化等重要发育程序中的作用。