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基于双sgRNA的金针菇CRISPR/Cas9基因组编辑系统的建立
1 农业部农业环境微生物工程重点实验室，南京农业大学生命科学学院微生物学系，南京 210095，江苏；sheltonliu@foxmail.com (XL)；10318127@njau.edu.cn (JD)；10317128@njau.edu.cn (JL)；2020116058@stu.njau.edu.cn (LT)；2020816130@stu.njau.edu.cn (HQ)；wt1170450810@hotmail.com (TW)；2021816129@stu.njau.edu.cn (FG)；jingzhu@njau.edu.cn (JZ)；shiliang@njau.edu.cn (LS)；aljiang@njau.edu.cn (AJ)； yuhans@njau.edu.cn (HY); mwzhao@njau.edu.cn (MZ) 2 南京农业大学三亚学院，三亚 572025，中国 3 贵州省科学院生物研究所，贵阳 550009，中国 * 通讯地址：angren@njau.edu.cn；电话/传真：+86-25-84395602 † 这些作者对本文的贡献相同。
通过GFP-Reporter测定法恢复单切SGRNA的敏感且可靠的评估
大多数Duchenne肌肉营养不良（DMD）病例是由一个或多个外显子的删除或重复引起的，这些外显子破坏了DMD mRNA的阅读框架。恢复阅读框允许产生部分功能性肌营养不良蛋白，并导致症状不太严重。反义寡核苷酸介导的外显子跳过已被批准用于DMD，但是该策略需要重复治疗。crispr/cas9还可以恢复室内读取框架。尽管最近的体内研究表明单切换/外显子跳过策略的功效，但缺乏找到特定突变的最有效的单切SGRNA的方法。在这里，我们表明插入/删除（Indel）产生效率和Indel曲线都有助于读取框架恢复单切SGRNA的效率，因此只检查Indel频率的测定无法找到最佳的SGRNA。因此，我们开发了一种GFP重复蛋白测定法，以评估单切性效率，并报告了这两个方面的综合效应。我们表明，GFP-Reporter分析可以可靠地预测肌细胞中SGRNA的性能。此GFP-报告基因测定法可以有效，可靠地找到最有效的单切SGRNA来恢复肌营养不良蛋白的表达。
基本编辑器的随机多重SGRNA组装的定向稻基因
基于CRISPR的摘要定向进化是一种有效的繁殖生物技术，可改善植物中的农艺特征。然而，使用单个单个指南RNA，其基因多样化仍然受到限制。我们在这里描述了多重的正交基础编辑器（MOBE），以及随机多重的SGRNA组装策略，以最大程度地提高基因多样化。bobe可以在不同的目标上诱导有效的正交安倍（<36.6％），CBE（<36.0％）和A＆CBE（<37.6％），而SGRNA组装策略随机基础编辑各个目标上的基础编辑事件。与稻米乙酰辅酶A羧化酶（OSACC）的第34外显子的每个链中的130和84个靶标相应，我们观察到了随机双重双重和随机三重SGRNA库中的目标 - 折叠组合。我们使用MOBE和大米中的随机双重SGRNA文库进一步进行了OSACC的定向演变，并获得了更强的除草剂耐药性的单个或连接的突变。这些策略对于功能基因的原位定向演变很有用，并且可能会加速大米的性状改善。
CRISPR-Cas9 介导的精准微生物基因组编辑，借助目标错配的 sgRNA
CRISPR-Cas9 系统彻底改变了基因组编辑。CRISPR-Cas9 由单分子向导 RNA (sgRNA) 和蛋白质 Cas9 核酸酶组成，后者可识别特定靶序列和原型间隔区相邻基序 (PAM) 序列，然后切割目标 DNA 序列。该 CRISPR-Cas9 系统已被用作有效的负选择工具，用于在位点特异性诱变过程中切割未编辑或未改变的靶 DNA，从而获得具有所需突变的微生物细胞。本研究旨在调查 CRISPR-Cas9 系统在细菌体内寡核苷酸定向诱变中的基因组编辑效率。该系统成功地在大肠杆菌的 galK 中引入了 2 到 4 个碱基的突变，编辑效率很高 (81% − 86%)。然而，单点突变（T504A 或 C578A）很少引入，并且编辑效率非常低（<3％），这可能是由于错配耐受性所致。为了解决这个问题，我们在 sgRNA 序列中设计了一个或两个碱基的错配，以识别大肠杆菌中 galK 的靶序列。使用单碱基错配的 sgRNA，在 36％−95％ 的负向选择的大肠杆菌细胞中成功引入了单点核苷酸突变（galK 基因中的 T504A 或 C578A）。通过使用错配的 sgRNA 的全基因组单碱基编辑实验，随机选择了 16 个靶标。因此，在 48 个所需的单碱基突变中，使用错配的 sgRNA 成功编辑了 25 个单碱基。最后，为微生物基因组中的单核苷酸编辑提供了适用的靶标错配 sgRNA 设计规则。
小分子调控的 sgRNA 能够通过 Cas9 控制大肠杆菌中的基因组编辑
CRISPR-Cas9 已为广泛应用的基因编辑带来了巨大进步。为了进一步发挥 Cas9 的效用，人们一直在努力实现对其核酸酶活性的时间控制。虽然不同的方法都侧重于调节哺乳动物细胞中的 CRISPR 干扰或编辑，但所有报道的方法都无法控制细菌中的核酸酶活性。在这里，我们开发了 RNA 接头，将茶碱和 3-甲基黄嘌呤 (3MX) 结合适体与 sgRNA 结合起来，从而实现大肠杆菌中的小分子依赖性编辑。这些可激活的向导 RNA 能够实现对体内基因编辑的时间和转录后控制。此外，它们还减少了因基因组切割而导致的宿主细胞死亡，这是 CRISPR 介导的细菌重组的主要限制。
利用随机多路复用 sgRNA 组装碱基编辑器进行定向进化水稻基因
摘要 基于 CRISPR 的定向进化是一种有效的育种生物技术，可改善植物的农艺性状。然而，使用单个单向导 RNA 其基因多样化仍然有限。我们在这里描述了一种多重正交碱基编辑器 (MoBE) 和一种随机多重 sgRNA 组装策略，以最大化基因多样化。MoBE 可以在不同的靶标上有效诱导正交 ABE (< 36.6%)、CBE (< 36.0%) 和 A&CBE (< 37.6%)，而 sgRNA 组装策略将各种靶标上的碱基编辑事件随机化。对于水稻乙酰辅酶 A 羧化酶 (OsACC) 第 34 外显子的每一条链上的 130 个和 84 个靶标，我们在随机双 sgRNA 和随机三重 sgRNA 文库中观察到多达 27 294 种靶标-支架组合类型。我们进一步利用MoBE和随机双sgRNA文库对水稻中的OsACC进行了定向进化，获得了更强的除草剂抗性的单突变或连锁突变。这些策略可用于功能基因的原位定向进化，并可能加速水稻性状改良。
缩回：优化SGRNA来改善CRISPR/CAS9敲除效率：特别关注人类和动物细胞
近年来，在各种情况下（医疗，工业等）中非侵入性脑界面（BCI）设备的扩展和应用的扩展为标志。这项技术允许代理“直接用思想行动”，绕过外围运动系统。有趣的是，值得注意的是，典型的非侵入性BCI范式与人类自愿行动的神经科学模型保持远距离。值得注意的是，在BCI实验中，动作和感知之间的双向联系不断忽略。在当前的观点文章中，我们提出了一种创新的BCI范式，该范式直接受到意识运动原则的启发，该原则假定自愿行动是由即将到来的感知效应的预期代表所驱动的。我们认为（1）适应BCI范式可以允许简单的动作效应结合和因此作用效应预测，并且（2）使用这些动作效应预测的神经基础作为AI方法中感兴趣的特征，可能导致更准确和自然主义的BCI BCI介导的动作。
用于 CRISPR/... 的 R 语言多功能向导 RNA 设计包
CRISPR/Cas9 基因编辑应用的成功依赖于与 Cas9 蛋白结合使用的单向导 RNA (sgRNA) 的效率。当前的 sgRNA 设计软件在 sgRNA 序列效率方面提供的细节各不相同，并且通常将生物选择限制在开发人员选择的物种列表中。crispRdesignR 软件包旨在通过在单个程序中提供生成的 sgRNA 的全面序列特征来解决这些限制，这使用户能够预测 sgRNA 效率并为当前没有优化效率评分方法的系统设计 sgRNA 序列。crispRdesignR 报告了所有设计的 sgRNA 序列的大量信息，具有强大的脱靶调用和注释，并且可以在用户友好的图形界面中运行。crispRdesignR 软件包在 R 中实现，具有完全可编辑的代码，可用于特殊目的，包括用户提供的基因组中的 sgRNA 设计。该软件包独立于平台且可扩展，其源代码和文档可在 https://github.com/dylanbeeber/crispRdesignR 免费获取。
sgrnas-correates-with-...
CRISPR/CAS9基因组编辑用于破坏HeLa细胞中的CXCR4基因座。CXCR4编码与CXCL12趋化因子相互作用的细胞表面趋化因子受体，并在免疫系统中起重要作用。在本实验中，使用指南IT SGRNA筛选试剂盒测试了针对CXCR4基因座的四个不同的SGRNA。简要地，使用指南SGRNA在体外转录试剂盒中合成了针对CXCR4基因的SGRNA。一个包含SGRNA靶序列的PCR片段与重组Cas9蛋白和每个SGRNA混合。通过琼脂糖凝胶电泳分析裂解反应。光密度法（Cong等，2013）表明SGRNA3的裂解效率最低（图2）。