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PINK1 基因突变通过成对截短的 sgRNA/Cas9 实现
PTEN 诱导激酶 I (PINK1) 突变会导致人类早发性帕金森病 (PD)，并伴有选择性神经退行性病变。然而，目前 PINK1 基因敲除的小鼠和猪模型无法重现 PD 患者中观察到的典型神经退行性表型。这表明，在非人类灵长类动物 (NHP) 中生成与人类相近的 PINK1 疾病模型对于研究 PINK1 在灵长类动物大脑中的独特功能至关重要。配对单向导 RNA (sgRNA)/Cas9-D10A 切口酶和截短的 sgRNA/Cas9 均可以减少脱靶效应而不影响靶向编辑，是 CRISPR/Cas9 系统中用于建立疾病动物模型的两种优化策略。在这里，我们结合了这两种策略，将Cas9-D10A mRNA和两个截短的sgRNA注射到单细胞阶段的食蟹猴受精卵中，以靶向PINK1基因。我们实现了精准、高效的基因
AccuTool™ sgRNA-(GFP) 合成 (dRGEN)
DNA 引导的 RNA 引导内切酶 (dRGEN) 是高效、经济且方便的基因组编辑实验工具。AccuTool™ dRGEN 可识别长度为 23 bp 并以两个鸟嘌呤 (GG) 结尾的目标序列。定制 sgRNA 表达质粒可与 Cas9 表达质粒（人类密码子优化，WT/Nickase/Sniper 形式可用）一起使用。质粒可以通过任何标准方法（如脂质转染、纳米颗粒或电穿孔）递送到您感兴趣的细胞中，以实现高效递送。sgRNA-GFP 表达质粒是通过将 GFP 构建体插入现有 sgRNA 质粒中构建的。sgRNA-GFP 表达质粒可让您通过荧光显微镜确认细胞中的活性水平。 AccuTool™ dRGEN 是一种定制设计的 sgRNA，以 sgRNA 表达质粒或 sgRNA-GFP 表达质粒的形式提供。应用
通过双链DNA片段的单链DNA寡桥构建SGRNA-CAS9表达载体
总结本申请说明证明了将SGRNA序列插入靶向DNA组件的9.5 kb载体中的便利性。与传统的克隆方法不同，必须合成和重新弥补两个寡核体，该新协议提供了一种设计寡核的简单方法，并与所需的向量组装。Nebuilder HIFI DNA组装主混合物对传统方法的实质性改进，特别是节省时间，易用性和成本。
DNA组装与合成生物学
总结本申请说明证明了将SGRNA序列插入靶向DNA组件的9.5 kb载体中的便利性。与传统的克隆方法不同，必须合成和重新弥补两个寡核体，该新协议提供了一种设计寡核的简单方法，并与所需的向量组装。Nebuilder HIFI DNA组装主混合物对传统方法的实质性改进，特别是节省时间，易用性和成本。
使用内源性 U6 snRNA 启动子驱动的 CRISPR/Cas9 sgRNA 在核盘菌中进行有效的基因组编辑
我们之前报道了一种针对死体营养真菌植物病原菌核病菌的 CRISPR-Cas9 基因组编辑系统。该系统（TrpC-sgRNA 系统）基于 RNA 聚合酶 II（RNA Pol II）启动子（TrpC）在体内驱动 sgRNA 转录，成功创建了基因插入突变体。然而，相对低效率的靶向基因编辑阻碍了该方法在核病菌功能基因组研究中的应用。为了进一步优化 CRISPR-Cas9 系统，建立并评估了无质粒的 Cas9 蛋白/sgRNA 核糖核蛋白（RNP）介导的系统（RNP 系统）和基于质粒的 RNA 聚合酶 III 启动子（U6）驱动的 sgRNA 转录系统（U6-sgRNA 系统）。本研究针对之前鉴定的草酰乙酸乙酰水解酶 (Ssoah1) 基因座和一个编码聚酮化合物合酶 12 (Sspks12) 的新基因座创建了功能丧失突变体。RNP 系统与我们之前报道的 TrpC-sgRNA 系统类似，可以在 Ssoah1 基因座上以类似的效率产生突变。然而，这两个系统都未能在 Sspks12 基因座上成功产生突变。U6-sgRNA 系统在这两个基因座上都表现出明显更高的基因突变效率。该技术为靶向基因突变提供了一种简单有效的策略，从而将加快对这种具有重要经济价值的植物病原体的致病性和发展的研究步伐。
不耐受的不耐受性使有效的微生物单基因组编辑
摘要：CRISPR/CAS9系统最近已成为一种有用的基因特定编辑工具。然而，这种方法偶尔会导致由于不匹配耐受性而导致的DNA靶标和类似的DNA序列消化，这仍然是当前基因组编辑技术的显着缺点。但是，我们的研究确定，即使是靶DNA和5'截断的SGRNA之间的单基碱基不匹配也抑制了靶标识别。这些结果表明，5'截断的SGRNA/CAS9复合物可用于在微生物基因组中进行负选择单基本编辑的靶标。此外，我们证明了5'截断的SGRNA方法可用于简单有效的单基本编辑，因为它可以对DNA靶标的单个碱基进行修改，远离截短SGRNA的5'端。此外，当使用具有膨胀的原始探针邻近基序（PAM; 5'-NG）的工程Cas9核酸酶时，还允许5'截断的SGRNA进行有效的单基础编辑，这可以启用全基因组单基础量表。
www.bio-protocol.org/e3796 基于双 sgRNA 的靶向...
请引用本文：Jin and Marquardt, (2020). 基于双 sgRNA 的大型基因组区域靶向缺失和拟南芥中可遗传的 Cas9 无突变体的分离, Bio-protocol 10 (20): e3796. DOI: 10.21769/BioProtoc.3796。
使用马铃薯 X 病毒载体中的非间隔 sgRNA 阵列工程进行高效的 Cas9 多重编辑
基于成簇、规则间隔、短回文重复序列 (CRISPR) 和 CRISPR 相关蛋白 (Cas) 的系统彻底改变了许多生物体（包括植物）的基因组编辑。植物中的大多数 CRISPR-Cas 策略依赖于使用农杆菌进行遗传转化来提供基因编辑试剂，例如 Cas 核酸酶或合成向导 RNA (sgRNA)。虽然 Cas 核酸酶是编辑方法中的恒定元素，但 sgRNA 是靶向特异性的，通常需要筛选过程来识别最有效的 sgRNA。植物病毒衍生载体是将 sgRNA 快速有效地递送到成年植物中的一种替代方法，因为病毒具有基因组扩增和系统运动的能力，这种策略称为病毒诱导的基因组编辑。我们对马铃薯病毒 X (PVX) 进行了改造，以构建一种可在成年茄科植物中轻松表达多个 sgRNA 的载体。使用基于 PVX 的载体，本氏烟基因被有效靶向，在组成性表达化脓性链球菌 Cas9 的转化株系中产生近 80% 的插入/缺失。有趣的是，结果表明 PVX 载体允许表达不间隔 sgRNA 阵列，在成年植物组织中几天内实现高效的多重编辑。此外，可以从受感染组织或受感染植物种子再生的植物中获得无病毒编辑的后代，这些后代表现出高遗传双等位基因突变率。总之，这种新的 PVX 载体可以轻松、快速和高效地表达 sgRNA 阵列以进行多重 CRISPR-Cas 基因组编辑，并将成为跨不同植物物种（尤其是茄科作物）进行功能基因分析和精准育种的有用工具。
将 dsDNA 与 ssDNA Oligo 和 NEBuilder HiFi DNA 组装连接起来，创建 sgRNA-Cas9 表达载体
摘要 本应用说明展示了将 sgRNA 序列插入 9.5 kb 载体进行靶向 DNA 组装的便利性。与必须合成并重新退火两个寡核苷酸的传统克隆方法不同，此新方案提供了一种简单的方法来设计寡核苷酸并将其与所需载体组装。NEBuilder HiFi DNA 组装主混合物比传统方法有了显著的改进，特别是在节省时间、易于使用和成本方面。