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翠鸟柔性自动隔离病毒DNA/RNA的方案| neb
将打靶特定人源基因的 Cas9 和 sgRNA 转染到 HEK293 细胞。转染所用的质粒 DNA 上含有 表达带双端核定位序列 （ NLS ）的 Cas9 及 sgRNA 的表达框，通过 TransIT-X2 (Mirus) 转染 试剂进行转染。转染所用的 Cas9 mRNA 进行了假尿苷和 5- 甲基胞嘧啶修饰且带有双端 核定位序列，使用 transIT-mRNA 转染试剂将 sgRNA 和 mRNA 共转染。 Cas9 RNPs 使用脂质 体 RNAiMAX ( Life Technologies ) 进行反向转染， RNP 的终浓度为 10 nmol 。 Cas9 蛋白上不含 核定位序列。 EnGen Cas9 含有双端核定位序列。编辑效率通过 T7E1 实验进行分析，结果 以修饰百分比进行统计。
基因编辑
将打靶特定人源基因的 Cas9 和 sgRNA 转染到 HEK293 细胞。转染所用的质粒 DNA 上含有 表达带双端核定位序列 （ NLS ）的 Cas9 及 sgRNA 的表达框，通过 TransIT-X2 (Mirus) 转染 试剂进行转染。转染所用的 Cas9 mRNA 进行了假尿苷和 5- 甲基胞嘧啶修饰且带有双端 核定位序列，使用 transIT-mRNA 转染试剂将 sgRNA 和 mRNA 共转染。 Cas9 RNPs 使用脂质 体 RNAiMAX ( Life Technologies ) 进行反向转染， RNP 的终浓度为 10 nmol 。 Cas9 蛋白上不含 核定位序列。 EnGen Cas9 含有双端核定位序列。编辑效率通过 T7E1 实验进行分析，结果 以修饰百分比进行统计。
Lenti-X™CRISPR/CAS9系统用户手册
A.摘要CRISPR/CAS9基因编辑技术已使用形成复杂的两个关键成分彻底改变了基因组修饰领域：Cas9核酸内切酶和一个将Cas9引导到基因组DNA中特定目标位点的单个指南RNA（SGRNA）。Lenti-X CRISPR/CAS9系统（CAT。编号632629）是一个完整的系统，用于产生高产率的慢跑病毒，编码CRISPR/CAS9介导的基因组编辑所需的成分[即单个指导RNA（SGRNA）和Cas9核酸酶]，以将很难转发的哺乳动物细胞递送到哺乳动物细胞中。该系统还包含必要的控制和足够的试剂，用于构建10种不同靶（SGRNA）表达质粒。PLVX-HYG-SGRNA1矢量系统提供了其他线性化质粒，连接成分和Stellar™胜任的细胞。
Lenti-X™ CRISPR/Cas9 系统用户手册
A. 摘要 CRISPR/Cas9 基因编辑技术彻底改变了基因组修饰领域，它使用两种关键成分形成复合物：Cas9 内切酶和引导 Cas9 到达基因组 DNA 中特定靶位的单向导 RNA (sgRNA)。Lenti-X CRISPR/Cas9 系统 (目录号 632629) 是一个完整的系统，可高产量地生产慢病毒，这些慢病毒编码了 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑所需的成分 [即单向导 RNA (sgRNA) 和 Cas9 核酸酶]，可递送至难以转染的哺乳动物细胞。该系统还包含必要的对照和足够的试剂，用于构建 10 种不同的靶 (sgRNA) 表达质粒。pLVX-hyg-sgRNA1 载体系统提供额外的线性化质粒、连接成分和 Stellar™ 感受态细胞。
使用cas9- ...
抽象聚类定期间隔短的短质体重复序列/CRISPR相关蛋白9（CRISPR/CAS9）技术显着促进了基因编辑（GE）猪的产生。尽管GE Pigs有望用于农业和生物医学应用，但产生有用的GE Pig的整个过程是时间和劳动力密集的。为了克服这一点，已经开发了体内基因编辑技术，其中Cas9核酸酶和单引导RNA（SGRNA）直接注入动物中。但是，由于核酸酶的大尺寸，它们的效率保持较低。在这项研究中，我们通过将Cas9基因插入ROSA26基因座来产生表达CAS9的猪，从而在各种组织中产生其本构表达。我们还确认了猪的生育能力。对猪的原代细胞进行体外实验，仅通过添加SGRNA来证实有效的基因缺失。 这些结果表明，本研究中产生的表达CAS9的猪可以成为农业和生物医学研究中体内和体外基因编辑的有效平台。 关键字：猪，cas9，sgrna对猪的原代细胞进行体外实验，仅通过添加SGRNA来证实有效的基因缺失。这些结果表明，本研究中产生的表达CAS9的猪可以成为农业和生物医学研究中体内和体外基因编辑的有效平台。关键字：猪，cas9，sgrna
优化的CRISPR/CAS9腺病毒矢量（ADZ ... - -ORCA
抽象重组腺病毒载体可以在体外和体内实现高效的基因递送。结果，它们被广泛用于基因治疗，疫苗接种和抗癌应用中。我们以前已经开发了ADZ矢量系统，该系统使用重新组合来允许将转基因的高吞吐量克隆到腺病毒矢量中，简化了载体骨架的改变，并可以快速恢复感染性病毒，即使转基因与载体复制不符。在这里，我们适应了此矢量系统，以实现CRISPR/CAS9编辑的序列的高吞吐量克隆。向量以确保使用SPCAS9和SGRNA序列在单个矢量中使用SPCAS9和SGRNA序列的高编辑效率。使用50种感染的多样性，单个SGRNA可以实现高达80％的基因敲除效率。向量进一步增强，从而降低了靶向活性，但可以保持靶向效率，并对SGRNA序列进行修改，从而显着提高了编辑效率。因此，即使在难以转染细胞中，ADZ-CRISPR载体也提供了高效的敲除，并使大规模CRISPR/CAS9项目可以轻松，快速进行。
人类多能干细胞的碱基编辑用于模拟长 QT 综合征
规则，必须为20nt+PAM形式，突变位点在sgRNA编辑窗口2-8内，获得符合基因编辑条件的治疗靶点。为避免基因编辑过程中的旁观者编辑，我们建议仅对sgRNA编辑窗口2-8内的一个突变位点进行编辑。其他数据库如ClinVar（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）也是推荐的。
Transformer 碱基编辑器在哺乳动物细胞和小鼠中的设计与应用
将载脂蛋白 B mRNA 编辑酶、催化性多肽样胞苷脱氨酶与催化功能受损的 Cas 蛋白（例如 nCas9 或 dCas9）融合，提供了一种新型基因编辑技术，即碱基编辑，可高效地实现靶向碱基替换。然而，在碱基编辑中观察到全基因组和全转录组脱靶突变，这引发了对治疗应用的安全性担忧。之前，我们开发了一种新的碱基编辑系统，即 transformer 碱基编辑器 (tBE)，可在哺乳动物细胞和小鼠中诱导高效编辑，且不会观察到全基因组或全转录组脱靶突变。这里我们描述了设计和应用 tBE 的详细方案。本方案包括设计单向导 RNA (sgRNA) 和辅助 sgRNA 对、构建构建体、确定全基因组和转录组范围的脱靶突变、生产含有 tBE 的腺相关病毒、将腺相关病毒递送到小鼠体内以及检查体内编辑效果的步骤。使用 sgRNA-辅助 sgRNA 对，tBE 的高精度碱基编辑可以在 2-3 周内（在哺乳动物细胞中）或 6-8 周内（在小鼠中）完成。整个过程可以由研究人员使用分子生物学、生物信息学和小鼠饲养的标准技术共同完成。
使用整合和抗 CRISPR (IntAC) 在果蝇细胞中进行更高分辨率的全基因组 CRISPR 敲除筛选
2 霍华德休斯医学研究所，波士顿，MA 02115 通信：ram@genetics.med.harvard.edu (RV)；perrimon@genetics.med.harvard.edu (NP) 摘要 CRISPR 筛选可实现系统的、可扩展的基因型到表型映射。我们之前开发了一种用于果蝇和蚊子细胞系的汇集 CRISPR 筛选方法，使用质粒转染和位点特异性整合来引入单向导 (sgRNA) 文库，然后进行 PCR 和整合的 sgRNA 测序。虽然有效，但该方法依赖于早期组成型 Cas9 活性，这可能会导致基因组编辑和 PCR 检测到的 sgRNA 之间存在差异，从而降低筛选准确性。为了解决这个问题，我们引入了一种新方法来共转染表达抗 CRISPR 蛋白 AcrIIa4 的质粒以抑制早期 sgRNA 表达期间的 Cas9 活性，我们称之为“IntAC”（与抗 CRISPR 整合酶）。 IntAC 使我们能够构建一种由高强度 dU6:3 启动子驱动的新型 CRISPR 筛选方法。这个新库显著提高了整个基因组中适应性基因的精确度，在 5% 的误差范围内检索了 90-95% 的必需基因组，使我们能够生成迄今为止为果蝇组装的最全面的细胞适应性基因列表。我们的分析确定，IntAC 方法允许的升高的 sgRNA 水平推动了大部分改进。果蝇适应性基因与人类适应性基因表现出很强的相关性，并强调了旁系同源物对基因必需性的影响。我们进一步证明，IntAC 与靶向 sgRNA 子库相结合，能够在溶质超载下精确地正向选择转运蛋白。IntAC 是对现有果蝇 CRISPR 筛选方法的直接增强，显著提高了准确性，并且可能广泛应用于其他细胞类型（包括蚊子、鳞翅目、蜱虫和哺乳动物细胞）中的无病毒 CRISPR 筛选。
RNA 引导的睡美人转座重新定位......
摘要 基因治疗的理想工具是能够在人类基因组的预定位点上实现有效的基因整合。我们在此展示了睡美人 (SB) 转座子与 CRISPR/Cas9 系统的组件相结合而实现的偏向性全基因组整合。我们提供概念证明，通过将 SB 与催化失活的 Cas9 (dCas9) 融合并提供针对人类 Alu 逆转录转座子的单向导 RNA (sgRNA)，可以影响 SB 的靶位选择。转座子整合的富集依赖于 sgRNA，并且以不对称模式发生，偏向于 sgRNA 靶标下游相对较窄的 300 bp 窗口内的位点。我们的数据表明，CRISPR/Cas9 指定的靶向机制迫使整合到基因组区域，而这些区域原本是 SB 转座的不良靶标。未来对该技术的改进可能会允许开发用于精确基因工程的特定基因插入方法。