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SWISS：利用 Cas9 切口酶和工程 CRISPR RNA 支架在植物中进行多重正交基因组编辑
背景 单核苷酸替换、基因表达改变或有害基因的去除是植物许多重要农学性状的分子基础[1]。堆叠性状或改变调控途径的几个关键因素将极大地促进作物育种[1]。CRISPR-Cas 系统的多样性和简单性提供了强大的分子工具箱[2-10]。已采用多种策略在细菌、酵母和哺乳动物细胞中实现多重应用[11-16]。正交基因组操作最常用的多重策略包括几个正交 CRISPR 系统形成多功能 CRISPR 系统，例如使用 SpCas9 变体作为腺嘌呤碱基编辑器（ABE）和 SaCas9 作为胞嘧啶碱基编辑器（CBE）的双功能方法[17]，或使用 LbCpf1 变体作为 CRISPRa、SpCas9 变体作为 CRISPRi 和 SaCas9 变体作为删除的三功能方法[15]。然而，这些策略需要同时递送多个 Cas 蛋白，并且每个 Cas 蛋白都需要自己的 PAM 识别 [ 15 , 17 ]。另一方面，各种 RNA 适体被整合到 CRISPR RNA 支架中，这些适体
优化的CRISPR/CAS9腺病毒矢量（ADZ ... - -ORCA
抽象重组腺病毒载体可以在体外和体内实现高效的基因递送。结果，它们被广泛用于基因治疗，疫苗接种和抗癌应用中。我们以前已经开发了ADZ矢量系统，该系统使用重新组合来允许将转基因的高吞吐量克隆到腺病毒矢量中，简化了载体骨架的改变，并可以快速恢复感染性病毒，即使转基因与载体复制不符。在这里，我们适应了此矢量系统，以实现CRISPR/CAS9编辑的序列的高吞吐量克隆。向量以确保使用SPCAS9和SGRNA序列在单个矢量中使用SPCAS9和SGRNA序列的高编辑效率。使用50种感染的多样性，单个SGRNA可以实现高达80％的基因敲除效率。向量进一步增强，从而降低了靶向活性，但可以保持靶向效率，并对SGRNA序列进行修改，从而显着提高了编辑效率。因此，即使在难以转染细胞中，ADZ-CRISPR载体也提供了高效的敲除，并使大规模CRISPR/CAS9项目可以轻松，快速进行。
想成为基因编辑大师吗？
为SpCas9 经过一个点突变(D10A)，此突变会导致Cas9 只能进行单股核酸裁切(SSB)。使用上必须同时引入两段gRNA，辨认邻近的区域( 需要是DNA 双股各一股)，造成两个邻近的单股DNA 断裂，才能够引发NHEJ，造成基因缺失，因此可以大幅度降低off-target， 增加专一性。
用于基因组编辑的 Cas9 核糖核蛋白的制备
通过递送预组装的 Cas9 核糖核蛋白 (Cas9 RNP) 进行基因组编辑是一种越来越流行的方法，适用于难以通过传统质粒和病毒方法进行遗传操作的细胞类型。Cas9 RNP 编辑稳健、精确、能够多路复用且不含遗传物质。它在细胞中的短暂存在限制了残留的编辑活性。该方案描述了通过异源表达和从大肠杆菌纯化来制备重组化脓性链球菌 Cas9 (SpCas9) 蛋白，以及通过体外转录和 PAGE 纯化合成 CRISPR 向导 RNA。SpCas9 是第一个发现的 CRISPR Cas9（Jinek 等人，2012 年），也是基因组编辑应用中最典型的 Cas 酶之一。使用这种 Cas9 RNP 配方，我们已证明通过电穿孔在原代人类 T 细胞和自然杀伤 (NK) 细胞中以及通过聚乙二醇介导的转化在真菌和植物中实现了高效的基因组编辑。我们的 Cas9 RNP 制备协议是一致且简单的，可用于其他细胞类型和生物体的基因组编辑。
NIH推动妇女健康
基本编辑工具具有多样化的编辑范围和最小化的RNA脱离目标活动，需要广泛的应用程序。然而，当前的链球菌CAS9（SPCAS9）基于腺嘌呤碱基编辑器（ABES），具有最小的RNA脱离靶向活动的活动表现出具有效率编辑活动在位置4-8的效率编辑活动的结束编辑范围。在这里，使用SPCAS9内部的域插入程序和TADA变体组合不同的域插入Pro填充域，可以识别具有多样化的编辑范围和降低RNA非目标活性的功能性ABE变体。这项研究显示的ABE变体范围缩小，扩展或移动的编辑范围，跨质探索者位置有效的编辑活动2-16。与脱氨酶工程结合使用时，ABE变体的RNA非目标活动将进一步最小化。因此，域插入程序提供了一个框架来改善和扩展ABE工具包，其与ABE工程的其他策略相结合，将来值得进行全面的探索。
蛋白酶体的小分子抑制剂可提高 CjCas9 蛋白的稳定性
CjCas9 体积小，更容易载体化用于体内基因治疗。然而，与 SpCas9 相比，CjCas9 在靶基因中产生插入/缺失的效率通常较低。影响其功效的因素尚未确定。我们观察到，在 CMV 启动子下将该转基因转染到 HEK293T 细胞后，CjCas9 蛋白的表达量远低于相同条件下的 SpCas9 蛋白。因此，我们评估了蛋白酶体抑制剂对 CjCas9 蛋白稳定性及其对 FXN 基因编辑效率的影响。Western 印迹显示，添加 MG132 或硼替佐米可显著提高 HEK293T 和 HeLa 细胞中的 CjCas9 蛋白水平。此外，硼替佐米增加了在比 CMV 弱但对某些组织具有特异性的启动子（如 CBH 或 EFS）下表达的 CjCas9 蛋白的水平。最后，ddPCR定量分析显示硼替佐米处理增强了CjCas9在HEK293T细胞中敲除FXN基因GAA重复序列的效率，CjCas9蛋白稳定性的提高有利于其在CRISPR/Cas系统中的应用。
双功能II型II-B CRISPR-CAS9
cas9链球菌（SPCAS9）通过启用由RNA引导的可编程DNA裂解，彻底改变了基因组编辑。但是，SPCAS9耐受DNA-RNA双链体中的不匹配，这可能导致有害的脱靶编辑。在这里，我们揭示了来自弗朗西斯氏菌（Francisella novicida）（FNCAS9）的Cas9具有独特的结构特征 - REC3夹具，其本质上是其内在的高保真DNA靶向。通过动力学和结构分析，我们表明REC3夹具与R环的PAM-DISTAL区域形成关键接触，从而在酶激活过程中施加了新的检查点。值得注意的是，F。Novicida编码了非规范的小CRIS相关RNA（Scarna），该RNA（Scarna）使FNCAS9能够抑制内源性细菌性脂蛋白基因，从而颠覆宿主的免疫检测。fncas9与Scarna的结构说明了部分R环的互补性如何阻碍REC3夹具对接并防止裂解以支持转录抑制。REC3夹具在II型-B CRISPR-CAS9系统中保存，指出了工程精确基因组编辑者或制定新型抗菌策略的潜在途径。这些发现揭示了FNCAS9高特异性和毒力的双重机制，对生物技术和治疗发展具有广泛的影响。
使用API Mellifera中的集成基因编辑系统扩展CRISPR靶向位点
简单摘要：一种多功能基因操纵工具CRISPR/CAS9已被利用用于蜜蜂的靶向基因组工程。但是，到目前为止，仅证明已证明NGG识别的SPCAS9可以操纵A. Mellifera中的基因组，从而将可编辑的范围限制为NGG-包括基因座。在当前的研究中，为了评估使用CPF1，SPCAS9和SACAS9时的潜在扩展，我们通过生物信息学方法预测了整个Honeybee基因组中靶向位点的分布和数量。生物信息学分析的结果表明，A。Mellifera中可访问的目标位点的数量可以通过集成的CRISPR系统大大增加。此外，我们测量了这些新的CRISPR酶在Mellifera中的裂解活性，发现SACAS9和CPF1都可以诱导Mellifera中的基因组交替，尽管CPF1的诱变速率相对较低，而Sacas9的不稳定编辑速率相对较低。据我们所知，我们的研究提供了第一个证据，即SACAS9和CPF1可以有效地介导基因组序列突变，从而扩大了Mellifera中的可靶向光谱。 综合CRISPR系统可能会促进梅利弗拉（A. Mellifera）以及其他昆虫的应用研究。据我们所知，我们的研究提供了第一个证据，即SACAS9和CPF1可以有效地介导基因组序列突变，从而扩大了Mellifera中的可靶向光谱。综合CRISPR系统可能会促进梅利弗拉（A. Mellifera）以及其他昆虫的应用研究。
鉴定元素组对EH CRISPR -CAS9系统及其在基因组工程中的应用
抽象的非编码RNA（CRRNA）是由定期间隔短的短膜重复序列（CRISPR）基因座（CRISPR）基因座和与CRISPR相关的（CAS）的（CAS）的蛋白形成的，形成了crispr-CAS系统形成的复合物，这些复合物形成了与CAS-CataLe creeavage crre creage creeavage crrecry crrecry creeaveage crecrecry crrecry creeavage物质相互作用的相互作用的相互作用的creve criss cospectes。这些核糖蛋白启用的核酸易于编程的靶向促进了基于CRISPR的分子生物学工具的实施，用于体内和DNA和RNA靶标的体外修饰。尽管到目前为止鉴定出靶向DNA的Cas核酸酶的多样性，但在Pyogenes链球菌SPCAS9的天然和工程衍生物是基因组工程中最广泛使用的，至少部分是由于它们的CATA-LECALLYTIC稳健性以及一个异常短的图案（5''-ngg-ngg-3'''Pam）farnk sequence。但是，SPCAS9变体的大尺寸会损害该工具向真核细胞的传递，并且需要较小的替代品。在这里，我们在元基因组中识别与较小的CAS9蛋白（EHCAS9）相关的新的CRISPR-CAS9系统，该系统靶向以5'-NGG-3'PAM为两侧的DNA序列。我们开发了一种简化的EHCAS9工具，该工具专门切割DNA靶标，可用于原核生物和真核细胞中的基因组编辑应用。
工程慢病毒衍生的纳米颗粒（LVNP）用于...
使用CRISPR / CAS实施治疗性体内基因编辑，依赖于基因编辑工具的有效输送。由CAS蛋白和单个指南RNA（SGRNA）组成的核糖核蛋白（RNP）复合物提供了短期的编辑活性和安全优势，而不是惯性病毒和非病毒基因和RNA Delivery方法。通过工程慢病毒衍生的纳米颗粒（LVNP）促进RNP的递送，我们证明了SPCAS9以及SPCAS9衍生的基础和Prime Editor（BE / PE）的有效施用，从而导致受体细胞中的基因编辑。独特的GA G / GA GPOL蛋白融合策略促进了LVNP中的RNP包装，并确定LVNP stoichiometry y支持优化的LVNP收益率和治疗有效负载的纳入。我们将在4天内进行瞬时目标DNA C LEAV年龄，并在4天内完成RNP周转。结果，与培养细胞中标准的d rnp nuc Leofection相比，LVNP降低了靶向dna c leav年龄和tale of tar clea族的活性。lvnps可容纳be / sgrna和pe / epegrna rnps，导致基础编辑，旁观者编辑和质量编辑降低而无需检测到的indel indel形成。值得注意的是，在鼠标眼中，我们介绍了LVNP指导的体内基因破坏的第一个概念概念。我们的发现建立LVNP作为促进的车辆或促进RNP的交付