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干细胞研究
SPG11 中的双等位基因致病变异编码了 spatacsin，可导致罕见的运动神经元疾病，如遗传性痉挛性截瘫 11 型 (SPG11-HSP)、夏科-马里-图斯病和青少年型肌萎缩侧索硬化症-5 (ALS5)。SPG11-HSP 是最常见的复杂常染色体隐性 HSP。除了下肢痉挛和截瘫外，SPG11-HSP 患者还存在其他症状，如认知能力下降、上肢无力和周围神经病变（Pozner et al., 2020）。SPG11 编码一种 ~280 kDa 的蛋白质，称为 spatacsin，其参与自噬溶酶体机制的功能和囊泡运输。然而，由于缺乏特异性抗体，spatacsin 的确切功能尚不清楚。为了克服这一障碍，我们生成了一种内源标记的 SPG11 人诱导多能干细胞 (hiPSC) 系 (SPG11-HA)。标记是通过使用 CRISPR/Cas9 技术将具有同源定向修复的 HA 标签插入市售人类游离型 iPSC 系 (A18945；Thermo Fisher Scientific) 中进行的。用编码 SpCas9、GFP 和单个向导 RNA (gRNA；addgene) 的载体以及单链寡核苷酸 (ssODN) 供体 DNA 进行核转染。ssODN 包含一个 HA 编码区，两侧是 ~66 – 67 个核苷酸同源臂（图 1 AB）。经过单细胞分选程序和克隆扩增后，通过 PCR 扩增和桑格测序鉴定出阳性候选者（图 1 A）。通过 Sanger 和 Amplicon/NGS 测序确认了基因型 (图 1 A、C)。在预测的脱靶位点未检测到致病变异 (图 S1 A)。与未经过 CRISPR 过程的 iPSC 对照细胞 (ctrl) 相比，染色体微阵列分析未发现核转染报告系中存在任何从头拷贝数变异 (CNV) (图 1 D)。然而，在这两种细胞系中均发现了 20q11.21 处的增益。这种 CNV 在 hiPSC 和癌症中反复出现，表明它具有增殖或生存优势 (Nguyen et al., 2014)。ctrl 和 SPG11-HA iPSC 均表现出典型的多能性细胞样形态，并经支原体检测呈阴性 (图 S1 BC)。两种细胞系均表达多能性标记，并在三系分化范式测试中分化为所有三个胚层的衍生物（图 1 EF；图 S1 D；表 1）。为了验证报告细胞系的功能，通过蛋白质印迹研究了标记的 spatacsin 的表达。正如预期的那样，HA 标记的 spatacsin 在 280 kDa 的大小下可检测到（图 1 G）。由于 spatacsin 功能丧失后表现出一系列神经系统症状，因此评估了神经分化能力。近 90% 的分化对照和 SPG11-HA 神经祖细胞 (NPC) 表达
asahikawa市政医院医学杂志
类型的遗传型遗传名称病理ALS 1 AD SOD1 CU / Zn-超氧化物歧化酶ALS 2 AR Alsin蛋白水解和转运ALS 3 AD？未知的ALS 4 AD SETX SENATAXIN，DNA/RNA解旋酶，RNA代谢，AOA 2和等位基因ALS 5 AR SPG11 Spatacsin，遗传性痉挛性跨性别SPG 11和等位基因，轴突运输，轴突运输和Cytoskeleton Als 6 Ad fus 6 Ad fus fus sarcoma fy in in sarcoma fy inn sarcome febl ancom feb and gene gene and ft.未知ALS 8 AD VAPB突触囊泡结合膜蛋白，蛋白解和运输ALS 9 AD ANG ANG ANG ANG ANG ANG ANG蛋白，RNA代谢ALS 10 AD TARDBP TDP -43，RNA代谢ALS ALS ALS ALS 11 AD FIG4 FIG4 FIG4磷酸固醇-5磷酸固醇-5磷酸化酶的维持量，料理料中的含量12磷酸化12次氧化物。在身体维持中，蛋白水解和运输AD AD AD ATAXN2参与EGFR传输，SCA 2和等位基因，RNA代谢（ALS 14）AD VCP瓣膜 - 含有蛋白质，FTD，IBMPFD和等位基因ALS 15 XD UBQLN2 UBIQUIRIN，涉及蛋白质16的蛋白酶蛋白16 ARSS SOSIC ALSIC ALSIC SOSLIC ALSIC SOD ARSL SCLMS SOD SOLS SOLS SOLS SOLS SOL SCLMS SOL SCLMS SOL SCLMS SOL SCLMSS AR SCLMSS ARIP SOD SOLS SOLS SOLS SOLS SOL SIC chaperone (ALS 17) AD CHMP2B FTD may occur, proteolysis and transport ALS 18 AD PFN1 Profilin, actin binding, cytoskeletal structure regulation ALS 19 AD ERBB4 Type I receptor tyrosine kinase, NRG 1 receptor ALS 20 AD HNRNPA1 RNA metabolism ALS 21 AD MATR3 RNA metabolism ALS 22 AD TUBA4A Axonal transport and cytoskeleton ALS 23 AD ANXA11 Axonal transport and cytoskeleton ALS 24 AD NEK1 DNA repair/cell cycle ALS 25 AD KIF5A Intracellular transport ALS 26 AD TIA1 RNA regulation FTD - ALS 1 AD C9orf72 RNA metabolism, proteolysis and transport FTD - ALS 2 AD CHCHD10 Mitochondrial FTD - ALS 3 AD SQSTM1/p62蛋白水解和运输FTD -AD 4 AD TBK1蛋白水解和运输FTD -ALS 5 AD CCNF细胞周期FTD -AD VCP细胞内运输ALS ALS 14，ALS ALS 14和ALS FTD -ALS 7 AD CHMP2B内细胞内运输，ALS ALS 17和ALS ALS ALS 17和ALS ALS ALS ALS ALS ALS ALS ALS ALS ALS ALS ALS ALS 1 CATEL SCY -ALS ALS -ALS -ALS -ALS ALS ALS -ALS ALS ftd -8 -Als Als ftd -8 IBMPFD 2 AD HNRNPA2B1细胞内转运 /RNA调节AD /AR DCTN1 dynactin，细胞内转运，HMND 14 Perry综合征和等位基因AD /AR PRPH周围周围蛋白，细胞内转运AD /AR NEFH NEFH NEUROFILELANT -HEFH NEFH NEUROFILELANT -HEREFH NEUROFELILANT -H，INTRACELLICT -H，INTRACELLICTAR -H，INTRACELLILUL -2 CCMT，CMT，CMT，CMT CCCC。