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204 KSQ-004：SOCS1和Regnase-1的无偏成对发现是顶级CRISPR/CAS9双编辑组合，增强了对实体瘤的体内效力
背景CRISPR/CAS9基因编辑以增强T细胞产物细胞thera-therapies（ACT）的抗肿瘤活性（ACT）是一种有前途的方法，用于治疗实体瘤患者。我们开发了一种体内CRISPR^2筛选方法，并询问了顶部双重编辑组合，从而增强了T细胞抗肿瘤功能。我们发现，在T细胞靶标的所有可能的双编辑组合中，Regnase-1和SOCS1的失活导致体内抗肿瘤T细胞效能的最大增强。我们将这些发现应用于发现KSQ-004，这是一种Regnase-1/ SOCS1双重编辑的人CRISPR/ CAS9工程的TIL（ETIL）疗法，目前正在开发用于治疗的使用。我们生成了随机配对的CRISPR指南图书馆（CRISPR2），以先前的单基因免疫CRISPROMICS®屏幕为目标。crispr^2库具有超过1200个基因对的 crispr^2，在相关的合成性肿瘤模型中筛选在原代小鼠OT1和PMEL-TCR-TG-T细胞中。 然后在免疫疗法 - 饮食性B16F10转移性肺肿瘤模型中评估顶部双编辑组合。 在小鼠TIL模型中进一步评估了顶部组合的功效，其中从B16-OVA肿瘤中扩展了从B16-ova肿瘤进行扩展，并在体内进行了设计，并采用转移到肿瘤轴承宿主中以进行有效评估。 在CRISPR^2屏幕中测试的1200+组合的结果，Regnase-1/SOCS1组合在顶级双重编辑中排名，与对照组相比，这种组合增强了T细胞浸润到肿瘤> 3500倍。crispr^2，在相关的合成性肿瘤模型中筛选在原代小鼠OT1和PMEL-TCR-TG-T细胞中。然后在免疫疗法 - 饮食性B16F10转移性肺肿瘤模型中评估顶部双编辑组合。在小鼠TIL模型中进一步评估了顶部组合的功效，其中从B16-OVA肿瘤中扩展了从B16-ova肿瘤进行扩展，并在体内进行了设计，并采用转移到肿瘤轴承宿主中以进行有效评估。在CRISPR^2屏幕中测试的1200+组合的结果，Regnase-1/SOCS1组合在顶级双重编辑中排名，与对照组相比，这种组合增强了T细胞浸润到肿瘤> 3500倍。在检查点治疗难治性B16F10肺转移模型中进行的研究表明，Regnase-1/SOCS1双重编辑的PMEL-TCR-TG-TG-T细胞相对于对照组赋予了显着的SUR-VIAL益处，显着将动物中位数存活从21天延长至53天。进一步，regnase-1+SOCS1编辑的小鼠直到分离并从B16-ova肿瘤扩展并扩展，在将肿瘤重新灌注后完全控制了宿主，这表明该编辑组合通过这种编辑组合恢复了肿瘤经验丰富的蒂尔斯。将这些见解用于治疗用途，我们发现了KSQ-004，一种人类的Regnase-1/SOCS1双编辑CRISPR/CAS9设计的TIL（ETIL）。的方法来制造来自黑色素瘤和NSCLC肿瘤样品的KSQ-004，其依然表现出可靠的膨胀和可行性，可与未经编辑的对照截至，两种焦油的敲除超过90％。重要的是，KSQ-004在自体肿瘤刺激后产生升高的IFNγ，并在体外对肿瘤球体施加了更大的控制。结论我们使用了一种新型的CRISPR^2屏幕方法来识别Regnase-1/SOCS1作为肿瘤微环境中T细胞功能的顶级双编辑组合。，我们将这些发现转化为治疗用途，并发现了KSQ-004（一种设计的双重编辑的ETIL疗法，旨在提高抗肿瘤效力和针对实体瘤的持久性。
Lifileucel 治疗不可切除或转移性黑色素瘤
Lifileucel 采用一种新的作用机制来治疗 IV 期黑色素瘤，目前尚无推荐的自体肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL) 疗法。它由患者自身天然存在的免疫细胞 TIL 组成，这些细胞是从患者体内取出的癌性肿瘤样本中制备的，并在实验室中繁殖，直到获得数十亿个 TIL。然后通过静脉输注将扩增的 TIL 输回患者体内，目的是让 TIL 瞄准并浸润患者体内的癌症，并大量攻击癌症。如果获得许可，lifileucel 将为之前接受过治疗的不可切除或转移性黑色素瘤患者以及在接受多种疗法后病情恶化、目前没有其他有效选择的患者提供额外的治疗选择。
CRISPR 介导的 TGFBR2 敲除使人类卵巢癌肿瘤浸润淋巴细胞对 TGF-β 信号产生抗性
摘要 背景 卵巢癌 (OvCa) 患者 T 细胞浸润升高与生存率提高之间的相关性表明内源性肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL) 具有一定程度的抗肿瘤活性，可用于 OvCa 免疫治疗。我们之前优化了一种体外 OvCa TIL 扩增用于过继细胞疗法的方案，该方案目前正在我们机构的临床试验中进行测试 (NCT03610490)。在此成功的基础上，我们开始对 OvCa TIL 进行基因改造，以克服肿瘤微环境中存在的关键免疫抑制因素。在这里，我们介绍了在患者来源的 OvCa TIL 中 CRISPR/Cas9 介导的 TGF-β 受体 2 (TGFBR2) 敲除的临床前优化。方法 从四名患者手术切除的肿瘤样本中生成 OvCa TIL，并进行 CRISPR/Cas9 介导的 TGFBR2 敲除，然后进行快速扩增方案。全面评估了 TGFBR2 定向 gRNA 的 TGFBR2 敲除效率和脱靶活性。此外，还测定了 TGFBR2 敲除对 TIL 扩增、功能和下游信号传导的影响。结果在四个独立的 OvCa TIL 样本中测试的 5 个 gRNA 实现了从 59±6% 到 100%±0% 的 TGFBR2 敲除效率。TGFBR2 敲除的 TIL 对免疫抑制 TGF-β 信号传导具有抗性，表现为缺乏 SMAD 磷酸化、缺乏对 TGF-β 刺激的整体转录变化、在有和没有 TGF-β 的情况下促炎细胞因子的分泌同样强烈、并且在存在 TGF-β 的情况下细胞毒性增强。CRISPR 修饰本身不会改变 OvCa TIL 的体外扩增效率、免疫表型或 TCR 克隆多样性。对于临床转化而言，重要的是，对 CRISPR 脱靶效应的全面分析表明，我们前两个靶向 TGFBR2 的 gRNA 没有脱靶活性的证据。结论 CRISPR/Cas9 介导的基因敲除在患者来源的 OvCa TIL 中是可行且有效的，可使用临床可扩展的方法。我们实现了高效且特异性的 TGFBR2 敲除，产生了一种扩增的 OvCa TIL 产品，该产品对免疫抑制剂具有抗性
安全的患者处理和移动性设计标准
VA技术信息库（TIL）是退伍军人事务部（VA），VA管理，计划办公室，临床医生，行业，学术和研究组织，专家顾问以及建筑与设施管理办公室之间合作伙伴关系的顶点。通过整合了VA特定要求，联邦法律和法规，行业最佳实践的基准，基于证据的研究和设计以及基于增值的领先创新分析来开发出版物。va til（https://www.cfm.va.gov/til）为所有VA项目建立了计划和设计的基础。til文档在适当地应用于项目时，将最大程度地提高计划和设计过程的有效性和效率，并支持在护理环境中高水平的功能和质量。
指南国家临床建议，用于使用舒缓药物来缓解成人新出现的焦虑和URO症状的短期症状
国家卫生委员会的国家临床建议是系统准备的陈述，并参与了相关专业知识。在特定情况下，专业人员在做出适当和良好的临床保健益处时使用了国家临床建议。国家临床建议是公开可用的，因此公民和患者也可以在建议中实现自己。国家临床建议被归类为专业建议，这意味着国家卫生委员会建议相关专业人员遵循建议。国家临床建议在法律上没有约束力，这将始终是特定临床情况下的专业估计，这对于对适当和适当的健康专业福利的决定至关重要。尽管医疗保健专业人员遵循建议，但不能保证成功的治疗结果。在某些情况下，不建议使用的治疗方法可能更适合患者的情况。医疗保健专业人员通常在选择治疗时应涉及患者。
Amtagvi™（Lifileucel）医疗政策（PDF）
i。 ECOG性能状态> 1 II。绝对中性粒细胞计数（ANC）≤1,000/mm 3 III。血红蛋白<9.0 g/dl IV。血小板≤100,000/mm 3v。Alanine转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）≥5次正常（ULN）VI的上限。肌酐清除率<40 ml/min VII。左心室射血分数（LVEF）<45％VIII。有症状和/或未处理的脑转移IX。在考虑Amtagvi X之前至少3年未缓解的另一个主要恶性肿瘤的历史。不受控制或需要静脉注射或长期口服抗菌治疗XI的感染。HIV感染；仅当病毒载量无法检测到XII时才允许乙型肝炎或C病毒感染。 任何原发性免疫缺陷f。尽管有迹象表明或任何其他遗传修饰的TIL治疗，或者正在考虑使用任何其他遗传改性的TIL治疗G进行治疗，但尚未接受任何肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）治疗的治疗。仅在经过认证的TIL治疗中心h。试用与失败，禁忌或对BCBSM/BCN的利用管理医疗药物清单中列出的首选药物的不耐受HIV感染；仅当病毒载量无法检测到XII时才允许乙型肝炎或C病毒感染。任何原发性免疫缺陷f。尽管有迹象表明或任何其他遗传修饰的TIL治疗，或者正在考虑使用任何其他遗传改性的TIL治疗G进行治疗，但尚未接受任何肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）治疗的治疗。仅在经过认证的TIL治疗中心h。试用与失败，禁忌或对BCBSM/BCN的利用管理医疗药物清单中列出的首选药物的不耐受
黑色素瘤中的肿瘤淋巴细胞
恶性黑色素瘤是皮肤癌最具侵略性的形式，其特征是不可预测的生长模式，尽管采用了各种治疗方法，但在最近几十年中，其死亡率仍然令人震惊。改善黑色素瘤患者结局的一种有希望的策略在于早期使用生物标志物来预测预后。生物标志物提供了一种方法来衡量疾病课程初期的患者观点，促进及时，有针对性的干预。近年来，鉴于肿瘤的高免疫原性和对免疫治疗的潜在反应性，已经对免疫反应在黑色素瘤中的作用非常关注。研究人员致力于通过检查肿瘤微环境（TME）中的癌细胞生物学和免疫相互作用来识别预测性生物标志物。这种方法揭示了肿瘤 - 纤维淋巴细胞（TILS），这是一种在肿瘤中发现的一种免疫细胞。tils已成为一个有前途的研究领域，因为它们有潜力既是黑色素瘤的预后指标和治疗靶标。黑色素瘤组织中的tils的存在通常可以表明对癌症的阳性免疫反应，许多研究表明TIL可以改善患者的预后。本综述深入研究了黑色素瘤中TIL的预后价值，评估了这些免疫细胞如何影响患者的结果。它探讨了TILS与黑色素瘤细胞相互作用的机制以及利用TIL在治疗策略中的潜在临床应用。虽然tils提出了预后和治疗的充满希望的途径，但仍然存在挑战。这些包括了解TME内的TIL动力学的全部程度以及基于TIL的疗法的克服局限性。直到表征方法的进步对于重新填充基于TIL的方法也至关重要。通过解决这些障碍，以TIL为重点的研究可能为改善诊断和治疗方案铺平了道路，最终为黑色素瘤患者提供了更好的结果。
乳腺癌免疫治疗的创新方法
就 TMB 而言，更高水平的突变会导致新抗原生成增加，从而使肿瘤更具免疫原性。与其他形式的癌症（如黑色素瘤（每 MB 10 个））相比，乳腺癌被认为具有适中的突变率 [每兆碱基 (MB) 1 个] (3)。然而，TNBC 和 Her2+ 肿瘤的突变率可能明显更高 (4)。就 TIL 而言，这些细胞富含针对肿瘤相关抗原 (TAA) 的特异性，它们的存在表明肿瘤具有免疫原性。大多数乳腺癌都含有一些 TIL (5)，但一部分患者，尤其是患有 TNBC 和 Her2+ 肿瘤的患者，可能表现出高水平的 TIL (5,6)。例如，淋巴细胞为主型乳腺癌 (LPBC) 的特征是肿瘤组织中有 50% 以上的淋巴细胞浸润，其中 TNBC 的 LPBC 频率为 20%，Her2+ 的 LPBC 频率为 16%，ER+ 腔内乳腺癌的 LPBC 频率为 6% (5)。许多研究表明，无论是在乳腺癌的新辅助治疗还是辅助治疗中，TIL 频率的增加与预后改善相关 (5,7)。就肿瘤 (或 TIL) 表达 PD-L1/2 等抑制分子而言，这可能表明肿瘤一直处于免疫压力之下，从而导致
KSQ-001：一种针对实体肿瘤的 CRISPR/Cas9 工程肿瘤浸润淋巴细胞 (eTIL TM ) 疗法
利用体外扩增的肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL) 进行过继细胞疗法 (ACT) 为难治性实体瘤的治疗提供了一种潜在的变革性疗法。然而，免疫抑制性肿瘤微环境 (TME) 限制了 TIL 疗法的有效性。为了系统地识别有可能改善 TME 中 T 细胞功能的靶点，我们使用我们专有的 CRISPRomics ® 平台对免疫细胞进行了两次 CRISPR/Cas9 功能基因组筛选。第一次筛选采用了原代小鼠 T 细胞，并通过测量 sgRNA 向导富集来评估体内 T 细胞对肿瘤的浸润。值得注意的是，这种全基因组筛选确定了临床活性靶点，例如 PD-1，并确定了多个靶点，包括细胞疗法-1 (CT-1)。我们发现 CT-1 编辑的 TCR-Tg 小鼠 T 细胞在体内同源实体瘤模型中的效力比对照编辑的 T 细胞高 10 倍，这证明了灭活“CT-1”以在临床上启用 ACT 的潜力。第二个 CRISPR/Cas9 功能基因组筛选采用了人类 TIL，并评估了基因失活对标准制造条件下人类 TIL 扩增的影响。该筛选还将 CT-1 确定为首要目标。因此，我们优先开发 KSQ-001，这是一种工程化 TIL (eTIL TM ) 疗法，通过 CRISPR/Cas9 介导的 CT-1 编辑创建。我们识别并表征了针对 CT-1 的强效和选择性 sgRNA，并开发了高效工程化人类 TIL 的制造方法。与 TIL 相比，由人类黑色素瘤 TIL 制造的 KSQ-001 具有与增强的抗肿瘤效力一致的体外特性，包括增加 IFN γ 和 TNF α 的产生。总之，这些数据表明，我们的 CRISPRomics ® 平台能够全面识别和验证引人注目的新靶点，以开发强大的 eTIL TM 疗法，并支持对 KSQ-001 作为治疗难治性实体瘤的下一代过继细胞疗法进行临床评估。
嵌合抗原受体T细胞疗法
“免疫疗法”的开端可以说可以追溯到古埃及人。，他们像1800年代中期一样，像詹姆斯·佩吉特（James Paget），威廉·布希（Wilhelm Busch）和弗里德里希·费利森（Friedrich Fehleisen）一样，观察到一些癌症患者在感染后经历了肿瘤的消退。到1800年代后期，威廉·科利（William Coley）的“免疫疗法之父”开始进行注射，该注射是由死去的链球菌和塞拉蒂亚·马斯科斯（Serratia Marcescens）组成的，是一种免疫疗法的粗糙形式。他的工作是由他的女儿海伦·科利·瑙斯（Helen Coley Nauts）和劳埃德·旧的。Old致力于杆菌Calmette-guérin疫苗的抗肿瘤作用，并获得了“现代癌症免疫学之父”的名称。如今，免疫疗法的领域已在针对癌症的战争中提供了几支新的军备。这些包括使用单克隆抗体，细胞因子疗法（干扰素-α[IFN-α]和介毒素2 [IL-2]），免疫检查点抑制剂（抗CTLA-4，抗PD1和抗PD-L1），抗PD-L1，癌症/talimoge-pareme-parer-parer-parer-paremoigeNim-paremogogeNim-pare，共刺激性分子和收养细胞疗法（ACT）。建立在基因工程和分子生物学的十字路口上，ACT可以具有各种类型：肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）治疗，T细胞受体（TCR）工程T细胞疗法，天然杀伤剂治疗，或嵌合抗原受体（CAR）T-Cell治疗。其中，汽车T细胞受到了最大的关注，并表现出了最大的希望。在TIL治疗中，从患者的肿瘤活检标本中提取了TIL，然后与暴露于患者肿瘤中存在的新抗原的自体性细胞共培养。tils，使用IL-2在体外扩展，然后将其注入患者。TIL治疗在黑色素瘤，结直肠癌和乳腺癌中表现出了一些希望。 TCR T细胞疗法比TIL治疗的侵入性较小，因为所需的淋巴细胞来自患者的外周血，并且比TIL更加增殖。 提取，纯化和激活后，T细胞为TIL治疗在黑色素瘤，结直肠癌和乳腺癌中表现出了一些希望。TCR T细胞疗法比TIL治疗的侵入性较小，因为所需的淋巴细胞来自患者的外周血，并且比TIL更加增殖。提取，纯化和激活后，T细胞为