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改进的欧洲山杨染色体规模基因组组装和群体遗传学资源。
图 1 P. tremula v2.2 基因组概览。(A) P. tremula 1 号染色体 47.1 Kbp 区域的比较，显示 P. tremula v2.2 基因模型和 P. tremula v1.1 基因组和转录本的复制，在 PlantGenIE 中的 JBrowse 工具中呈现。绿松石色区域突出显示了 P. tremula v1.1 中包含基因的较长支架的示例。(B) P. tremula 和 P. trichocarpa 之间的同源性和结构重排。点表示两个物种之间的同源序列。红色表示同源序列之间的相同方向，蓝色表示相反方向。(C) 使用 PlantGenIE 中的 Venn 工具创建的维恩图，显示 P. tremula 特定区域中的基因交集和从同源性分析中识别出的 P. tremula 特定基因。
简单、高效、开源的 CRISPR/Cas9 策略用于欧洲山杨多位点基因组编辑
尽管 CRISPR/Cas9 系统已成功用于作物育种，但其在林木中的应用仍然有限。本文，我们描述了一种基于 Golden Gate MoClo 克隆的杂交杨树（Populus tremula × alba INRA 克隆 717-1B4）的有效基因编辑策略。为了测试系统生成单基因突变体的效率，设计了两个单向导 RNA (sgRNA)，并将其与 Cas9 表达盒一起整合到 MoClo Tool Kit 2 级二元载体中，以突变 SHORT ROOT (SHR) 基因。此外，我们还通过表达一个针对 YUC4 基因单个位点的 sgRNA 和另一个针对 PLT1 基因的 sgRNA 来测试其同时在两个基因中引入突变的效率。为了对该方法进行稳健评估，我们重复了该策略，使用独立的构建体同时靶向 LBD12 和 LBD4 基因。我们通过农杆菌介导的叶片转化产生了毛状根。测序结果证实了 PtaSHR 靶位点发生了 CRISPR/Cas9 介导的突变。检测到了双等位基因和纯合敲除突变。跨越两个靶位点的缺失和小插入/缺失是最常见的突变。在测序的 22 个 SHR 等位基因中，有 21 个发生了突变。表型表征表明，具有 SHR 基因双等位基因突变的转基因根缺乏明确的内胚层单细胞层，表明其基因功能保守，类似于拟南芥 Arabidopsis thaliana (L.) Heynh 中的同源物。测序结果还揭示了该系统产生双突变体的高效性。在评估的四个转基因根中，有三个 ( yuc4/plt1 ) 和两个 ( lbd12/lbd4 ) 检测到了 yuc4/plt1 和 lbd12/lbd4 根中两个基因的双等位基因突变。最常见的突变是单个靶位点的小片段缺失或单个核苷酸插入。这种 CRISPR/Cas9 策略是一种快速、简单且标准化的基因编辑工具，可用于评估基因在杨树根部径向细胞分化等重要发育程序中的作用。
CRISPR-Cas9 编辑咖啡酰莽草酸酯酶 1 和 2 显示了它们在 Populus tremula × P. alba 木质化中的重要性和部分冗余
摘要 木质素是位于细胞壁的芳香族聚合物，可为木质组织提供强度和疏水性。木质素单体通过苯丙烷途径合成，其中咖啡酰莽草酸酯酶 (CSE) 将咖啡酰莽草酸转化为咖啡酸。在这里，我们探讨了两种 CSE 同源物在杨树 (Populus tremula 9 P. alba) 中的作用。报告系显示 CSE1 和 CSE2 启动子赋予的表达相似。CRISPR-Cas9 产生的 cse1 和 cse2 单突变体具有野生型木质素水平。尽管如此，CSE1 和 CSE2 并非完全冗余，因为两个单突变体都积累了咖啡酰莽草酸。相比之下，cse1 cse2 双突变体的木质素减少了 35%，并导致相关的生长损失。降低木质素含量意味着在糖化程度有限的情况下，纤维素转化为葡萄糖的转化率增加了四倍。双突变体的酚类分析显示，代谢变化很大，除了咖啡酰莽草酸外，还包括对香豆酰、5-羟基阿魏酰、阿魏酰和芥子酰莽草酸的积累。这表明 CSE 具有广泛的底物特异性，这已通过体外酶动力学得到证实。总之，我们的结果表明，在羟基肉桂酰-莽草酸水平上，苯丙烷类途径中存在一条替代途径，并表明 CSE 是改善生物精炼植物的有希望的目标。