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使用多顺反子质粒载体验证伊蚊细胞中的 CRISPR 激活系统
伊蚊会将包括黄病毒在内的多种病原体传播给人类，导致高发病率和死亡率。由于适应性和气候变化，这些蚊媒预计将在新的地理区域定居，从而使更多的蚊子面临感染风险。因此，控制伊蚊媒介对于防止疾病传播是必要的。最近，遗传学方法在媒介控制方面显示出良好的前景；然而，操纵蚊子基因组的工具和方法相当有限。虽然 CRISPR-Cas9 系统已被用于伊蚊的基因编辑目的，但基于 dCas9 的基因转录控制仍未得到探索。在本研究中，我们报告了 CRISPR 激活系统在伊蚊细胞中的实施。为此，我们设计、构建和测试了一种基于双质粒的策略，该策略允许表达 dCas9-VPR 和靶向向导 RNA 以及报告基因盒。荧光报告基因水平的定量分析显示了强大的过表达，验证了伊蚊细胞中的 CRISPR 激活。该策略和生物学部分将成为基于合成转录因子的伊蚊基因强劲上调的有用资源，以应用合成生物学方法进行媒介控制。
利用 RNA 病毒载体对植物基因组进行可遗传的 CRISPR-Cas9 编辑
病毒感染的系统性传播促进了编辑成分在植物组织内的积累。这导致了高效和快速的基因组编辑，从而为评估单向导 RNA (sgRNA) 设计的有效性和特异性提供了理想的筛选工具。几种基于植物 RNA 病毒的复制子已成功用于在组成性表达 Cas9 核酸酶的转基因植物中传递 sgRNA。9–19 然而，每种病毒载体都有自己的分子生物学特性，并且仅限于特定的宿主范围。在这里，我们描述了两种源自马铃薯病毒 X (PVX；Potexvirus 属) 和烟草脆裂病毒 (TRV；Tobravirus 属) 的病毒载体的工程改造，用于在模型物种本氏烟中传递非间隔 sgRNA（图 1）。所提出的 PVX 系统由单个二元载体 pLX-PVX 组成，该载体包含 PVX 基因组序列和一个来自竹花叶病毒 (BaMV) 的异源亚基因组启动子以驱动插入表达 (图 2)。TRV 系统依赖于 pLX-TRV1 和 pLX-TRV2，这是两个具有兼容来源的 T-DNA 载体，可同时进行病毒基因组成分的农杆菌接种 (JoinTRV)。pLX-TRV1 提供复制酶功能，而 pLX-TRV2 包含一个工程化的 TRV RNA2 序列和一个来自豌豆早褐病毒 (PEBV) 的异源亚基因组启动子以驱动插入表达 (图 2)。这两个病毒系统均基于 pLX 系列的紧凑 T-DNA 二元载体20，这些载体已成功用于通过农杆菌介导的接种 (农杆菌接种) 启动 RNA 和 DNA 病毒感染。 21–23 重组病毒复制子与 sgRNA 构建体组装并通过农杆菌接种递送到表达 Cas9 的植物中。系统性病毒感染导致生殖系基因组编辑和编辑后代的恢复（图 1）。
用于脑疾病诊断和治疗的核酸药物载体
核酸药物具有靶点选择丰富、设计简单、疗效良好且持久等优点，在脑疾病治疗中被证实具有不可替代的优越性，而载体是治疗效果的决定性因素，循环中降解清除、血脑屏障、细胞摄取、内体/溶酶体屏障、释放等严格的生理屏障阻碍核酸药物通过载体送达脑部，针对单一靶点的核酸药物对治疗机制复杂的脑疾病效果不佳，患者个体差异导致核酸药物治疗脑疾病存在很大的不确定性。本综述首先简要总结了核酸药物的分类，然后讨论了药物输送过程中的生理屏障和普适性的应对策略，并介绍了这些普适性的应对策略在核酸药物载体上的应用方法，随后探讨了以核酸药物为基础的脑疾病联合治疗的多药方案及相应载体的构建。接下来，我们将讨论通过医学影像诊断信息对患者进行分层和个性化治疗的可行性以及将造影剂引入载体的方式。最后，我们将展望基于载体的脑疾病综合诊断和基因治疗的未来可行性和剩余挑战。
利用 RNA 病毒载体对植物基因组进行可遗传的 CRISPR-Cas9 编辑
液氮 n/an/a 关键商业检测 NEBuilder® HiFi DNA 组装预混液 New England Biolabs E2621S BsaIHF®v2 (20 U/µL) New England Biolabs R3733S Phusion TM 高保真 DNA 聚合酶 Thermo Fisher Scientific F530S MluI (10 U/µL) Thermo Fisher Scientific ER0561 ApaI (10 U/µL) Thermo Fisher Scientific ER1411 XhoI (10 U/µL) Thermo Fisher Scientific ER0691 EcoRI (10 U/µL) Thermo Fisher Scientific ER0271 RevertAid TM 逆转录酶 Thermo Fisher Scientific EP0441 RiboLock RNase 抑制剂 (40 U/μL) Thermo Fisher Scientific EO0381 NucleoSpin® 质粒试剂盒 Macherey-Nagel 740588.250 Zymoclean 凝胶 DNA 回收试剂盒 Zymo Research D4001 Zymo-Spin I Zymo Research C1003-250 嗜热菌 (Tth) DNA 聚合酶 Biotools 10.003 寡核苷酸 D1789 GGGAATCAATCACAGTGTTGGC
植物基因组工程中用于基因传递的有前景的纳米载体
摘要：高效的基因传递系统对于植物基因工程至关重要。传统的传递方法已被广泛使用，例如农杆菌介导的转化、聚乙二醇 (PEG) 介导的传递、基因枪轰击和病毒转染。然而，这些技术的基因型依赖性和其他缺点限制了基因工程的应用，特别是许多农作物的基因组编辑。迫切需要开发新的基因传递载体或方法。最近，纳米材料如介孔二氧化硅颗粒 (MSN)、AuNP、碳纳米管 (CNT) 和层状双氢氧化物 (LDH) 已成为将基因组工程工具 (DNA、RNA、蛋白质和 RNP) 高效地以物种独立的方式传递给植物的有前途的载体。已经报道了一些令人兴奋的结果，例如成功将货物基因传递到植物中以及产生基因组稳定的转基因棉花和玉米植物，这为植物基因组工程提供了一些新的常规方法。因此，本文综述了纳米材料在植物遗传转化中的应用进展，并讨论了不同方法的优势和局限性，强调了纳米材料在植物基因组编辑中的优势和潜在的广泛应用，为纳米材料在植物基因工程和作物育种中的应用提供指导。
利用 RNA 病毒载体在拟南芥中进行可遗传的碱基编辑
拟南芥中的可遗传碱基编辑可在 CESA3 处产生获得功能突变。A，纤维素合酶 3 (CESA3) 中的 esgRNA 靶标。C 到 T 的转变诱导
通过单农杆菌系统简化植物基因沉默和基因组编辑物流，同时递送多部分病毒载体
图 1 JoinTRV 的设计，这是一种基于具有兼容来源的微型 T-DNA 载体的 TRV 表达系统。(A) 烟草脆裂病毒 (TRV) 的基因组组织。(B) TRV RNA2 工程用于序列克隆和表达。pLX-TRV2 的克隆盒图与 Bsa I 识别位点和 Bsa I 产生的突出端一起显示（底部）。LacZ 报告基因允许可视化选择重组载体；插入物的植物表达由豌豆早褐病毒 (PEBV) 外壳蛋白 (CP) 启动子驱动。(C) VIGS (pTRV2) 和 VIGE (pRNA2.PEBV) 中描述的 pLX-TRV2 和 TRV RNA2 载体的尺寸比较。(D) JoinTRV 系统图。两个 T-DNA 载体被多路复用到单个农杆菌细胞中，以同时递送 TRV 基因组成分。 pLX-TRV2 是 pLX-B2 衍生物，具有 pBBR1 来源和卡那霉素抗性基因 (npt I)，pLX-TRV1 是 pLX-Z4 衍生物，具有 RK2 来源和庆大霉素抗性基因 (aac C1)；由于这两个 T-DNA 载体具有兼容的来源和独立的抗生素选择机制，因此可以同时寄宿在同一细菌细胞中
利用 S/MAR 载体对 Usher 综合征进行非病毒基因治疗的研究。
开发载体 在项目开始时，Moosajee 教授的团队已经为 USH2A 开发了几种 S/MAR 载体原型。由于基因太长，这一过程非常具有挑战性，但团队最终通过将基因打碎成碎片，然后像拼图一样将它们一个接一个地插入包装中实现了这一目标。然而，在校对包装后的 USH2A 的整个基因序列时，研究人员发现了一个字母的拼写错误。他们现已纠正这个问题，并能够确认他们已成功将正确的 USH2A 序列插入 S/MAR 载体中。他们还加入了各种特殊信号（称为启动子），这些信号可以促使基因在大多数细胞或特别是在视网膜细胞中开启。载体本身是该项目的一个重要成果，现在可用于未来的研究和模型系统中的测试。
VipariNama：RNA病毒载体可快速阐明基因表达与表型之间的关系
合成转录因子有望成为阐明基因表达与表型之间关系的工具，因为它允许对基因表达进行可调改变，而无需对所研究的基因座进行基因组改变。然而，植物转化需要数年时间、高成本和技术技能，限制了它们的使用。在这项工作中，我们开发了一种名为 VipariNama (ViN) 的技术，其中基于烟草脆裂病毒的载体用于快速部署基于 Cas9 的合成转录因子并在植物体内重新编程基因表达。我们证明 ViN 载体可以在数周内在本氏烟、拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 和番茄 (Solanum lycopersicum) 中系统地、持续地激活或抑制多个基因。通过探索包括 RNA 支架、病毒载体集合和病毒工程在内的策略，我们描述了如何提高调控的灵活性和有效性。我们还展示了这种转录重编程如何对代谢表型产生可预测的变化，例如本氏烟草中的赤霉素生物合成和拟南芥中的花青素积累，以及发育表型，例如本氏烟草、拟南芥和番茄中的植物大小。这些结果证明了如何使用基于 ViN 载体的赤霉素信号不同方面的重编程在几周内设计一系列植物物种的植物大小。总之，ViN 将产生表型的时间从一年多缩短到几周，为合成转录因子支持的假设检验和作物工程提供了一种有吸引力的转基因替代方案。
辅助依赖性腺病毒载体在 CRISPR-cas9 介导的肺癌基因治疗中的潜力
摘要 自从利用 CRISPR/Cas9 编辑 DNA 以来，基因治疗领域见证了基因编辑的巨大进步，为治疗囊性纤维化 (CF) 等疾病开辟了新途径。CF 是由囊性纤维化跨膜传导调节器 (CFTR) 基因突变引起的。尽管使用 CRISPR/Cas9 在体外进行基因编辑取得了成功，但在体内使用 CRISPR/Cas9 治疗 CF 肺病仍然存在挑战。将 CRISPR/Cas9 递送到肺部以及难以达到临床疗效所需的效率带来了新的挑战。病毒和非病毒载体已被证明可以成功地在体内递送 DNA，但 CFTR 的持续表达不足。在辅助依赖性腺病毒载体 (HD-Ad) 引入之前，使用第一代病毒载体治疗肺部遗传疾病的临床试验显示疗效有限。由于 HD-Ad 具有容量大、免疫原性低等优点，再加上 CRISPR/Cas9 系统的多功能性，将 CRISPR/Cas9 通过 HD-Ad 递送至气道用于肺部基因治疗具有巨大潜力。在这篇综述中，我们讨论了 CRISPR/Cas9 在 CF 基因治疗中的应用现状、该领域现有的挑战以及 CRISPR/Cas9 在肺部的存在带来的新障碍。通过对这些挑战的分析，我们提出了使用 HD-Ad 载体进行 CRISPR/Cas9 介导的肺部基因治疗的潜力，并以囊性纤维化肺部疾病为治疗模型。关键词：腺病毒，基因治疗，气道基因递送，Cas9，囊性纤维化