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使用您喜欢的向量克隆有毒靶标和不稳定的DNA
图1。有毒基因产物成功克隆在CopyCut ER™Epi400™电用量细胞中。大肠杆菌ACP（酰基载体蛋白，抑制细胞生长）和噬菌体T4 regb（分别裂解细菌RNA，对大肠杆菌剧毒的RNA内核酸酶）分别将其克隆到高拷贝矢量PUC18或PET11中。transformax™EC100™细胞中的全长ACP克隆在测序时包含多个点突变。
用于（表观）基因组编辑和基因治疗的 mRNA 反式剪接双 AAV 载体
大基因包括几个 CRISPR-Cas 模块，如基因激活剂 (CRISPRa)，需要双腺相关病毒 (AAV) 载体才能有效地在体内传递和表达。当前的双 AAV 载体方法具有重要的局限性，例如重建效率低、产生外来蛋白质或分裂位点选择的灵活性低。在这里，我们介绍了一种基于通过 mRNA 反式剪接 (REVeRT) 重建的双 AAV 载体技术。REVeRT 在分裂位点选择方面具有灵活性，可以在多种体外模型、人类类器官和体内有效地重建不同的分裂基因。此外，REVeRT 可以通过单一或多重方法在不同的给药途径上功能性地重建针对各种小鼠组织和器官中基因的 CRISPRa 模块。最后，REVeRT 能够在 Stargardt 病小鼠模型中玻璃体内注射后重建全长 ABCA4。由于其灵活性和效率，REVeRT 在基础研究和临床应用方面具有巨大潜力。
使用多顺反子质粒载体验证伊蚊细胞中的 CRISPR 激活系统
伊蚊会将包括黄病毒在内的多种病原体传播给人类，导致高发病率和死亡率。由于适应性和气候变化，这些蚊媒预计将在新的地理区域定居，从而使更多的蚊子面临感染风险。因此，控制伊蚊媒介对于防止疾病传播是必要的。最近，遗传学方法在媒介控制方面显示出良好的前景；然而，操纵蚊子基因组的工具和方法相当有限。虽然 CRISPR-Cas9 系统已被用于伊蚊的基因编辑目的，但基于 dCas9 的基因转录控制仍未得到探索。在本研究中，我们报告了 CRISPR 激活系统在伊蚊细胞中的实施。为此，我们设计、构建和测试了一种基于双质粒的策略，该策略允许表达 dCas9-VPR 和靶向向导 RNA 以及报告基因盒。荧光报告基因水平的定量分析显示了强大的过表达，验证了伊蚊细胞中的 CRISPR 激活。该策略和生物学部分将成为基于合成转录因子的伊蚊基因强劲上调的有用资源，以应用合成生物学方法进行媒介控制。
利用 S/MAR 载体对 Usher 综合征进行非病毒基因治疗的研究。
开发载体 在项目开始时，Moosajee 教授的团队已经为 USH2A 开发了几种 S/MAR 载体原型。由于基因太长，这一过程非常具有挑战性，但团队最终通过将基因打碎成碎片，然后像拼图一样将它们一个接一个地插入包装中实现了这一目标。然而，在校对包装后的 USH2A 的整个基因序列时，研究人员发现了一个字母的拼写错误。他们现已纠正这个问题，并能够确认他们已成功将正确的 USH2A 序列插入 S/MAR 载体中。他们还加入了各种特殊信号（称为启动子），这些信号可以促使基因在大多数细胞或特别是在视网膜细胞中开启。载体本身是该项目的一个重要成果，现在可用于未来的研究和模型系统中的测试。
开发模块化双生病毒载体以实现植物的高表达和基因靶向
* 通讯地址：电话：919-515-5729；电子邮件：jmalonso@ncsu.edu 摘要 病毒载体可以成为表达重组蛋白以及递送基因编辑机制的有用工具。尽管它们很有用，但这些工具的开发和后续优化通常是一个困难而繁琐的过程。因此，尽管已经做了大量工作来创建用于基因编辑和蛋白质表达的有用病毒载体，但对于如何最好地设计这些载体以用于特定应用，人们缺乏了解。例如，通常不清楚加入异源启动子序列或不同的病毒成分是否会改善货物表达或复制子积累。为了解决其中一些障碍，我们设计了一种基于双生病毒 - 甜菜卷叶病毒 (BCTV) 的 GoldenBraid (GB) 兼容病毒载体系统。该系统允许对各种报告构建体进行简单的模块化克隆。利用这种模块化克隆策略，我们比较了各种替代病毒载体架构。有趣的是，天然 BCTV 启动子的表现优于组成型 35S 启动子，而 BCTV 病毒体正义基因的去除则促进了报告基因的表达。有趣的是，这些修改对总复制子积累没有影响。这些结果表明了新的模块化基于 BCTV 的病毒载体在蛋白质表达和基因靶向应用方面的实用性，同时也揭示了可能为未来基于双生病毒的病毒载体架构提供信息的设计原则。我们预计，这种新模块化系统的推出将引发基于复制子的策略在植物蛋白质表达和基因编辑实验中的广泛应用。关键词：病毒载体、基因编辑、甜菜曲顶病毒、双生病毒、GoldenBraid、瞬时表达。简介病毒载体已被证明可用于各种生物技术应用，例如基因组编辑和蛋白质表达。基于双生病毒的病毒载体已用于递送基因组编辑酶，例如锌指核酸酶 (ZFN) 和 Cas9，以及用于同源定向修复 (HDR) 的修复模板 (RT) (Butler 等人，2016 年；Wang 等人，2017 年；Yu 等人，2020 年；Gil-Humanes 等人，2017 年；Dahan-Meir 等人，2018 年，Eini 等人，2022 年)。
一组用于利用野生型菌株多样性的解脂耶氏酵母 CRISPR/Cas9 载体
摘要 目的 构建和验证一组含有六种不同标记的解脂耶氏酵母 CRISPR/Cas9 载体，可编辑几乎任何遗传背景，包括野生型菌株的遗传背景。 结果 使用 Golden Gate 方法，我们组装了一组六个 CRISPR/Cas9 载体，每个载体含有不同的选择标记，用于编辑工业酵母解脂耶氏酵母的基因组。此载体组可通过 Addgene 获得。使用 Golden Gate 组装，可以轻松快速地将任何向导 RNA (gRNA) 序列引入这些载体中的任何一个。使用这六个载体中的五种，我们成功地编辑了各种遗传背景（包括野生型菌株）中的六种不同基因。使用这些载体大大改善了特定位点的同源重组和盒式整合。结论我们已经创建了一套多功能、模块化的 CRISPR/Cas9 载体，可以快速编辑任何解脂耶氏酵母菌株；该工具将
腹侧换段区域的GABA能神经元表示和调节力量
图1。奖励喷口位置的变化引起的力量在不同方向上施加了力量，而不会改变奖励预测。（a）。连续测量在头部固定装置中受约束的小鼠中向后和向后的劳累的连续测量。（B-C）带有不同喷口位置的Pavlovian调节任务设计。（D-E）双向力的劳累取决于相同会话内的吐口位置。小鼠表现出与喷口位置对齐的方向（n = 12）的力量。（f）小鼠在不同方向上施加力作为条件和无条件的响应（左：CR，配对t检验，t = 9.473，p <0.0001；右：ur rign：ur，ur，成对t检验，t = 9.556，p <0.0001）。（G-H）在喷口位置变化时一致的舔行为。（i）左，与条件响应相同的舔率（配对t检验，t = 1.758，p = 0.107）。右，与无条件响应的舔速度相同（配对t检验，t = 0.0624，p = 0.951）。
CRISPR-CAS12A基因组在整个植物水平上使用两个兼容的RNA病毒载体
摘要使用可以在宿主植物中复制并系统地移动的病毒载体以传递细菌CRISPR组件，从而可以在整个植物水平上进行基因组编辑，并避免对劳动力密集型稳定转化的要求。但是，这种方法通常依赖于先前转化的植物，这些植物稳定地表达了CRISPR-CAS核酸酶。在这里，我们描述了使用烟草eTCH病毒（TEV； PotyVirus属）和马铃薯病毒X（PVX; PVX;属Potexvirus）得出的两个兼容的RNA病毒载体的成功无DNA的基因组编辑，这些病毒是在同一细胞中复制的。TEV和PVX载体分别表达CAS12A核酸酶和相应的指导RNA。这种新型的两场媒介系统改善了植物中无病毒诱导的基因组编辑的工具箱，并将促进繁殖更多营养，耐药性和生产性作物的努力。
白纹伊蚊和马来伊蚊中肠转录组对登革热和基孔肯雅病毒的反应
登革热 (DENV) 病毒和基孔肯雅 (CHIKV) 病毒是最常见的虫媒病毒。虽然白纹伊蚊和马来伊蚊主要通过埃及伊蚊叮咬传播，但它们也是有效的媒介，并对虫媒病毒流行病学产生影响。在这里，为了填补我们对次级载体和虫媒病毒之间分子相互作用的理解空白，我们使用转录组学分析了感染后 1 天和 4 天 (dpi) 时白纹伊蚊对 CHIKV 以及马来伊蚊对 CHIKV 和 DENV 的全基因组反应。在白纹伊蚊中，1793 个和 339 个基因分别在 1 dpi 和 4 dpi 时受到 CHIKV 的显著调控。在 A. malayensis 中，在 CHIKV 感染时有 943 个和 222 个基因在 1 dpi 和 4 dpi 时显著受调控，在 DENV 感染时有 74 个和 69 个基因在 4 dpi 时显著受调控。我们报告了 81 个基因在所有 CHIKV 感染条件下持续差异调节，确定了 CHIKV 诱导的特征。我们使用从头组装的 A. malayensis 中肠转录组，确定了两种蚊子中表达的免疫基因，并描述了免疫结构。我们发现 JNK 通路在所有条件下都被激活，将其抗病毒功能推广到伊蚊。我们的全面研究为多种伊蚊媒介传播虫媒病毒提供了见解。
VipariNama：RNA病毒载体可快速阐明基因表达与表型之间的关系
合成转录因子有望成为阐明基因表达与表型之间关系的工具，因为它允许对基因表达进行可调改变，而无需对所研究的基因座进行基因组改变。然而，植物转化需要数年时间、高成本和技术技能，限制了它们的使用。在这项工作中，我们开发了一种名为 VipariNama (ViN) 的技术，其中基于烟草脆裂病毒的载体用于快速部署基于 Cas9 的合成转录因子并在植物体内重新编程基因表达。我们证明 ViN 载体可以在数周内在本氏烟、拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 和番茄 (Solanum lycopersicum) 中系统地、持续地激活或抑制多个基因。通过探索包括 RNA 支架、病毒载体集合和病毒工程在内的策略，我们描述了如何提高调控的灵活性和有效性。我们还展示了这种转录重编程如何对代谢表型产生可预测的变化，例如本氏烟草中的赤霉素生物合成和拟南芥中的花青素积累，以及发育表型，例如本氏烟草、拟南芥和番茄中的植物大小。这些结果证明了如何使用基于 ViN 载体的赤霉素信号不同方面的重编程在几周内设计一系列植物物种的植物大小。总之，ViN 将产生表型的时间从一年多缩短到几周，为合成转录因子支持的假设检验和作物工程提供了一种有吸引力的转基因替代方案。