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PNEB193 2713 BP
saci smai bshii paci sbfi sbfi ecoi访问acci的bamhi xbai xbai xbai sali sali psti psti psti psti hindii agtgaattcgicgtccccccggggggggggggcggcgtcitatatagtagtcightgtgtgtgtgtgtgtgtgtggtggcsggctggctgctctscats。。。。。。。。。。4o
用于基因组 DNA 消化的限制性酶...
甲基化不敏感的ISSCHIZOMER（市售）Aflii Cttaag 1 5 Asei Attaat 2 4 Avrii CCTAGG 1 5 BAMI GTATCC 1 5是的是-Bcli GCCNC TGTACA 1 5 BCLI GCCNC TGTACA 1 5 BSTEIIIIC 5 econnnagg ii aagctt 1 5是kpni ggtac 5 1是是msci tggcca 3 3 muni/mfei caattg 1 5是Ncoi Cctggg 1 5是Ndei catatg catatg catatg ctgcag 5 1 ctgcag 5 1 yes pvuii is是的Sphi xbai stuit stuig 5是xmni gaannttc 5 5是是
φx174
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基因编辑φx174
There are no restriction sites for the following enzymes: AarI(x), Acc65I, AcuI, AfeI, AgeI, AlwI, AlwNI, ApaI, AscI, AsiSI, AvrII, BamHI, BanII, BclI, BglI, BglII, BlpI, BmgBI, BmrI, BmtI, BsaI, BsaXI, BsgI, BsmBI, BspDI, BspEI, BsrFI, BsrGI, BstBI, BstEII, BstYI, BstZ17I, Bsu36I, ClaI, DpnI, DpnI, EagI, EcoN, EcoO1 FseI, FspAI(x), HindIII, I-CeeI, I-SceI, CPNI，MBOI，MSCI，NEI，NCOI，NDEI，NGOMIV，NHEI，NENI，NSSII，NSSII，NSPI，PFLI，PFLI，PMMI，PMLI，PMLI，P; PMLI，P; PMLI，P; PMLI，PPUTMI，PPHMI，PPHMI，PPHMI，PPHMI，PPHMI，P; PSPOME，PSPXI，PVI，PVII，RSRII，SACI，SALI，SALI，SANDI（X），SAU3AI，SBFI，SFII，SFII，SFII，SGRI，SGRI，SGRI，SMAI，SMAI，SMAI，SNABI，SPEI，SPEI，SPEI，SPHI，SPHI，SPHI，SRFMI（SRFMI（X）
碱基编辑酶 APOBEC3A 以低效率和高选择性催化 RNA 中的胞嘧啶脱氨
A3A 和 eA3A 表达。A3A 表达构建体 (Addgene #109231) 之前已有描述，可用于纯化 A3A 作为融合蛋白 (MBP-A3A-His)，可进一步加工以生成分离的 A3A 结构域。32,33 对于 eA3A (A3A-N57G)，N57G 突变是通过 Q5 定点诱变 (New England Biolabs, NEB) 引入的。A3A 和 eA3A 构建体的细菌表达之前已有详细描述。 33 将纯化的 MBP-A3A-His、MBP-eA3A-His 或分离的 A3A 在 50 mM Tris-Cl（pH 7.5）、50 mM NaCl、10% 甘油、0.5 mM DTT 和 0.01% Tween-20 中透析过夜，并使用 BSA 标准曲线确定蛋白质浓度。基于 SwaI 的脱氨酶对 ssDNA 和嵌合底物的活性。5'-荧光素 (FAM) 荧光标记的底物 S35-dC 或具有单个靶核糖胞嘧啶的匹配底物（在其他 DNA 骨架中）（S35-rC）由 Integrated DNA Technologies (IDT) 合成，以及相关产品对照（S35-dU 和 S35-rU）。在最佳 A3A 反应条件（最终为 20 mM 琥珀酸：NaH 2 PO 4：甘氨酸 (SPG) 缓冲液 pH 5.5，0.1% Tween-20）下，用 6 倍稀释的未标记 A3A（从 1 µM 到 4 pM）处理 100 µM 寡核苷酸。反应在 37 ˚C 下进行 30 分钟，然后终止（95 ˚C，10 分钟）。然后加入 200 nM 互补链并退火。加入 SwaI (NEB)，在室温下消化过夜。加入甲酰胺上样缓冲液，样品加热变性（95 ˚C，20 分钟），然后在 50 ˚C 下在 20% 变性 TBE/尿素聚丙烯酰胺凝胶上运行。使用 Typhoon 成像仪（GE Healthcare）上的 FAM 滤光片对凝胶进行成像。使用 ImageJ 中的面积量化工具进行定量分析。720 碱基对 ssDNA 底物的合成。为了生成 ssDNA，使用 720 bp gBlock 基因片段 (IDT) 作为模板 (补充图 2a)，并使用 Taq 聚合酶 (NEB) 进行扩增，采用指数后线性 (LATE) PCR 反应方案，该方案采用相对于磷酸化的反向引物过量的正向引物。32 对反应物进行纯化 (NucleoSpin、Fisher)，然后在 37 ˚C 下用 核酸外切酶处理 1 小时以降解磷酸化链，然后进行热失活 (90 ˚C，10 分钟)。然后将产物在 2% 琼脂糖凝胶上运行，并使用凝胶 DNA 回收试剂盒 (Zymoclean) 回收 ssDNA。通过乙醇沉淀进一步纯化 ssDNA，并使用 Qubit ® 荧光计 (ThermoFisher) 测量其浓度。对于一个重复，ssDNA 以大分子寡核苷酸 (IDT) 的形式获得，并通过乙醇沉淀进一步纯化。720 聚体 RNA 底物的合成。使用 720 bp 基因块 (IDT) dsDNA 作为模板，在推荐条件下使用 TranscriptAid Enzyme Mix (ThermoFisher) 通过体外转录生成 RNA，并在 37 ˚C 下孵育两小时。然后通过苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀纯化 RNA。将样品重新悬浮在无核酸酶的水中，并进一步用 MspI、XbaI 和 AclI 限制性酶 (NEB) 处理以消化任何剩余的 DNA 模板。在 37 ˚C 下孵育 1 小时后，使用 RNA Clean and Concentrator-5 试剂盒 (Zymo Research) 纯化 RNA。为了进一步确保完全去除模板 DNA，在 37 ˚C 下用 DNase I (Ambion) 处理 RNA 30 分钟。重复纯化 (RNA Clean and Concentrator-5)，并使用 Qubit ® 荧光计测量纯化 RNA 的浓度。通过“预测二级结构网络”预测 720 聚体中几个中尺度区域的二级结构