。cc-by 4.0国际许可(未经Peer Review尚未获得认证)是作者/资助者,他已授予Biorxiv的许可证,以永久显示预印本。这是该版本的版权持有人,该版本发布于2025年3月6日。 https://doi.org/10.1101/2025.02.28.640817 doi:Biorxiv Preprint
105,也可以根据CC0许可使用。(未通过同行评审认证)是作者/资助者。本文是美国政府的工作。不受此前版本的版权持有人的版权,该版本于2024年6月11日发布。 https://doi.org/10.1101/2023.12.14.571787 doi:Biorxiv Preprint
(Cytiva)。LNP 货物是编码工程 AsCas12a 核酸酶和 gRNA 的 mRNA,重量比为 1:1。通过 RiboGreen 测定法(ThermoFisher Scientific)评估 LNP 的包封率大于 80%,多分散性指数 (PDI) <0.2,通过 Zetasizer 分析(Malvern Panalytical,型号 ZSU3205)评估平均直径大小 <105 nm。• 细胞培养处理:用指定浓度的包封 AsCas12a mRNA 的 LNP 处理细胞,并在转染后 72 小时分离 gDNA。原代人肝细胞 (PHH) 的转染包括重组人载脂蛋白 E。进行基于扩增子的下一代测序 (NGS) 以确定编辑百分比。 • 小鼠眼内体内编辑:通过前房内注射将 LNP 递送至每只 hMYOC Y437H(具有 Y437H 突变的人类肌动蛋白基因)敲入小鼠的一只眼中。注射后一周,解剖眼球,从前房分离 mRNA。采用基于转录本的 RT-ddPCR 检测来测量剩余 hMYOC mRNA 的程度。 • 小鼠肝脏内体内编辑:通过尾静脉静脉注射将 LNP 递送至 hMYOC Y437H 小鼠。注射后一周,解剖肝脏,分离 gDNA,并进行基于扩增子的 NGS 以确定编辑百分比。 • 体外结合亲和力测量:将标记的未修饰的向导与重组工程 AsCas12a 和浓度不断增加的修饰“测试”向导混合,在室温下孵育 3 小时,然后在硝酸纤维素印迹膜 (Cytiva) 和 Hybond N+ 膜 (Cytiva) 上进行双重过滤分离。在每个膜上定量荧光标记的未修饰向导,并计算结合的未修饰向导的百分比。标记的未修饰向导的结合百分比降低是由于来自修饰的“测试”向导的结合竞争。
•开发了一种LCMS-HRMS方法,用于对API(Butivacaine)的分离,鉴定和定量,其对映异构体,主要脂质,胆固醇和胆固醇和胆固醇氧化产物在Exparel®多蛋白脂质体药物制剂中。•对所有脂质进行了定量或半定量分析,并在属于六个不同脂质类别的样品中鉴定了24个不同的小脂质。•从确定的小脂质中,有22个是磷脂,其他是三酰基甘油。•2种胆固醇氧化产物(COD; 7-酮胆固醇和7α-羟基胆固醇)在Exparel®样品中鉴定并量化。