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World File Search System共转染
囊性纤维化患者细胞中的 P.F508del 编辑
基因组编辑方法的发展为基于病因的遗传性疾病治疗方法的开发创造了新的机遇。在这里，我们证明 CRISPR/Cas9 可以纠正囊性纤维化 (CF) 患者来源的 CFTE29o- 细胞和诱导多能干细胞 (iPSC) 中 CFTR 基因的 p.F508del 突变。我们使用了 Cas9、sgRNA 和 ssODN 的几种组合，并测量了内源性 CFTR 基因和含有 p. F508del 突变 CFTR 基因座的共转染质粒的编辑效率。CFTE29o- 细胞中 CFTR 基因中的非同源末端连接 (NHEJ) 频率从等位基因的 1.25% 到 2.54% 不等。内源性 CFTR 基因座中最好的同源定向修复 (HDR) 频率为等位基因的 1.42%。在 iPSC 中，CFTR 基因中的 NHEJ 频率从等位基因的 5.5% 到 12.13% 不等。HDR 效率最高的是等位基因的 2.38%。我们的结果表明，在 CF 患者来源的 iPSC 中使用 CRISPR/Cas9 进行 p.F508del 突变编辑是一种相对罕见的事件，应进行后续细胞选择和培养。
lamivudine（3TC），一种核苷逆转录酶抑制剂，可防止突变tau转基因小鼠中存在的神经病理改变
摘要：转座元件的失调导致神经退行性疾病。先前的研究报告说，果蝇模型以及人的tauopathies中的逆转录子转录增加。在这种情况下，我们在P301S小鼠中测试了逆转录酶抑制剂，即拉米夫丁（也称为3TC），这是基于FTDP-17-TAU过表达的阿尔茨海默氏病动物模型。通过饮用水施用拉米夫丁的转基因P301S小鼠在以下典型的tauopath的组织病理学标记中显示出降低：tau磷酸化；炎症；神经元死亡；和海马萎缩。lamivudine治疗减弱了运动率（Rotarod测试）和改善的短期记忆（Y-Maze检验）。为了评估tau在逆转录中的作用，我们用含有完整的线-1序列和新霉素的盒式盒子和新霉素的盒式磁带，并与tau序列共转染HeLa细胞。line-1插入大大增加。此外，拉米夫丁抑制了线1的插入。我们的数据表明，在神经病理学的第一个症状下，通过兰米夫定给予tauopathy的进展。
ßA1-晶体蛋白 HDR 质粒 (m): sc-419822-HDR
含有由 CRISPR/Cas9 系统产生的双链断裂 (DSB) 的 DNA 可以通过非同源末端连接 (NHEJ) 或同源定向修复 (HDR) 途径进行修复 (1,2,3)。NHEJ 修复途径在切割位点引入非特异性插入或缺失，而 HDR 途径允许在 DSB 位点进行精确的基因编辑 (1,2,3)。靶向特异性 HDR 质粒为 DSB 提供 DNA 修复模板，当与 CRISPR/Cas9 KO 质粒共转染时，能够在发生 Cas9 诱导的 DNA 切割的位置插入特定的选择标记 (1,2)。HDR 质粒可以整合红色荧光蛋白 (RFP) 基因以直观地确认转染，并整合抗生素抗性基因 (嘌呤霉素) 以选择含有成功 CRISPR/Cas9 双链断裂的细胞。嘌呤霉素抗性和 RFP 编码基因两侧是两个 LoxP 位点，这些位点可被 Cre 载体识别，之后可利用该位点从基因组 DNA 中去除这些选择标记 (4,5)。
Alt-R HDR 设计工具和 HDR 供体寡核苷酸
图 1.与其他修饰相比，具有 Alt-R HDR 修饰的供体寡核苷酸表现出更高的 HDR 效率。 图 1.与其他修饰相比，具有 Alt-R HDR 修饰的供体寡核苷酸表现出更高的 HDR 效率。 （A）供体寡核苷酸修改的示意图。 （B）每次修改的 HDR 效率。使用 4D-Nucleofector™ 系统（Lonza）将四个靶向基因位点的 RNP 复合物（2 µM）与 0.5 µM 单链 HDR 供体寡核苷酸通过电穿孔共转染到 Jurkat 和 HeLa 细胞中。使用的 RNP 复合物是 Alt-R Sp HiFi Cas9 Nuclease V3，以及 Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA 和 tracrRNA。 使用了三种类型的供体寡核苷酸：未经任何修饰的寡核苷酸（未修饰的）、具有硫代磷酸酯键的寡核苷酸（PS 修饰的）和具有 Alt-R HDR 修饰的寡核苷酸（Alt-R HDR 修饰的）。 电穿孔后 48 小时 (HeLa) 或 72 小时 (Jurkat) 提取基因组 DNA。通过在 Illumina™ MiSeq™ 系统 (v2 化学、150 bp 双端读取) 上进行扩增子测序来测量 HDR 效率。
通过 CRISPR/Cas9 介导的同源重组将人类 gdnf 敲入牛 β-酪蛋白基因座*
帕金森病 (PD) 是一种常见且使人衰弱的神经退行性疾病，其源于多巴胺能神经元的损失，并伴有进行性运动功能障碍。神经胶质细胞衍生的神经营养因子 (GDNF) 在治疗 PD 和其他神经病方面非常有前景。在本研究中，我们应用 CRISPR/Cas9 技术开发了一种基因靶向敲入系统，用于在牛 β-酪蛋白基因位点表达人类 gdnf 基因。构建了 CRISPR/Cas9 表达质粒和 pP40-GN 载体。使用组织外植体法培养和收集牛胎儿成纤维细胞。然后将 pP40-GN 和 CRISPR/Cas9 载体电转染到牛胎儿成纤维细胞中。使用 G418 筛选抗性克隆，同时通过 PCR 分析和 PCR 产物测序鉴定目标克隆。采用耳组织阻断法成功分离培养牛胎儿成纤维细胞，将pP40-GN靶载体和CRISPR/Cas9表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞，经7天G418筛选，共获得12个健康、分离良好的细胞克隆，其中5个发生基因打靶事件。本研究为利用基因打靶牛乳腺生物反应器生产人GDNF蛋白奠定了基础，为PD的靶向治疗提供了新的策略。
使用简单的传染性克隆系统
基因型匹配的疫苗也提供了理想的保护，以防止新纽卡斯尔病毒病毒（NDV）基因型或变体引起的感染，即使在接种疫苗的鸡中也是如此。在这项研究中，我们使用一个简单可靠的感染性克隆平台报告了一种衰减和快速开发作为有效疫苗候选者的衰减和快速开发的方案。基于DHN3，一种基因型VII速度NDV分离株，通过表达基因组RNA，NDV蛋白NP，P和L的质粒的共转染来挽救重组RDHN3，而无需使用辅助病毒的T7聚合酶。随后，通过在DHN3 F蛋白中用氨基酸112至117的残基取代的菌株RDHN3-MF产生，并具有来自lasota菌株的相应序列。在细胞培养和鸡蛋中，RDHN3和RDHN3-MF在传播过程中均具有遗传稳定。通过确定EID 50，MDT和临床评估的进一步表征，证实了RDHN3具有速度和RDHN3-MF lentogentic。与灭活的RDHN3-MF的一周大的SPF小鸡相比，与商业lasota疫苗相比，抗DHN3抗体反应和对实时DHN3挑战的疫苗接种产生的抗DHN3抗体反应和更好的保护能力更高，提供了100％的保护和更早的病毒清除率。这种衰减的NDV分离株值得进一步发展为疫苗产品。
一种多功能、高效的植物原生质体平台...
基因组编辑技术发展的最终目标是实现任何细胞或生物体中精准的基因组改变。本文我们描述了原生质体系统，该系统利用预组装的 Cas9 核糖核蛋白 (RNP) 复合物在拟南芥、本氏烟、白菜和亚麻荠中实现精准、高效的 DNA 序列改变。Cas9 RNP 介导的双 gRNA 基因破坏在拟南芥原生质体中可达到约 90% 的插入/缺失。为了便于测试任何 Cas9 RNP 设计，我们开发了两个 GFP 报告基因，从而可以灵敏地检测非同源末端连接 (NHEJ) 和同源定向修复 (HDR)，编辑效率分别高达 85% 和 50%。当与最佳单链寡脱氧核苷酸 (ssODN) 供体共转染时，RNP 通过 HDR 对 AtALS 基因的精确编辑达到 7%。值得注意的是，预组装引物编辑器 (PE) RNP 介导的精确诱变导致原生质体中 GFP 报告基因回收率为 50%，基因组中特定 AtPDS 突变的编辑频率高达 4.6%。原生质体中 CRISPR RNP 变体的快速、多功能和高效基因编辑为开发、评估和优化基因和基因组操作的新设计和工具提供了宝贵的平台，适用于多种植物物种。
duxap8通过下调microRNA-29A-3P表达
摘要。- 目的：研究长链非编码RNA（LNCRNA）DUXAP8在卵巢癌（OCA）和潜在的机制中的作用。患者和方法：使用GEPIA数据库对卵巢癌中DUXAP8的表达模式进行了处理。定量实时聚合酶链反应（QRT-PCR）用于确定OCA组织中DUXAP8的表达。同时，将OCA细胞系培养以完成功能实验，包括细胞计数KIT-8（CCK-8），板克隆实验和Transwell Excorentes，以评估DUXAP8对OCA细胞系的增殖和迁移能力的影响。生物信息学分析和双lu- ciferase报告基因用于确定OCA细胞中Duxap8与其下游关键基因MicroRNA-29A-3P的结合和表达。此外，还使用共转染技术和细胞功能恢复实验来验证OCA中DUXAP8/ microRNA-29A-3P调节网络的重要作用。结果：在OCA组织和细胞系中，DUXAP8异常上调，其表达与患者的前进性不佳有关。cck-8和板克隆概述表明，OCA细胞中DuxAP8的敲低可以显着抑制OCA细胞的增殖。Transwell结果表明，DuxAP8的敲低可以显着抑制OCA细胞迁移。此外，发现DuxAP8可以结合并负调节OCA中microRNA-29A-3P的表达。结论：DUXAP8在OCA中的表达异常高，可以导致肿瘤的恶性进展。在OCA细胞中进行的功能实验表明，microRNA-29A-3P是介导DUXAP8在OCA功能上调节的关键下游基因。
CRISPR 破坏和英国生物库对高度保守的多态性增强子的分析表明，该基因与男性焦虑和乙醇摄入有关
摘要 全球 5.9% 的死亡与过量饮酒有关。然而，这一数字在男性中尤其严重，7.6% 的死亡可归因于饮酒。先前的研究发现，在不同男性群体中，甘丙肽 (GAL) 基因的基因型与焦虑和酒精滥用之间存在显著的相互作用，但无法确定其中的机制。为了解决这些问题，本研究分析了英国生物银行的人类队列，并发现高度保守的人类 GAL5.1 增强子的等位基因变异 (GG 或 CA 基因型)、酒精摄入量 (AUDIT 问卷分数) 和男性焦虑之间存在显著的相互作用 (n = 115,865; p = 0.0007)。至关重要的是，使用 CRISPR 基因组编辑破坏小鼠的 GAL5.1 显著降低了杏仁核和下丘脑中的 GAL 表达，同时相应减少了 KO 小鼠的乙醇摄入量。有趣的是，我们还发现雄性 GAL5.1KO 动物的焦虑样行为减少的证据与我们在英国生物库研究中看到的人类相似。通过生物信息学分析和共转染研究，我们进一步确定了 EGR1 转录因子，该因子与杏仁核和下丘脑中的 GAL 共同表达，对蛋白激酶 C (PKC) 支持的 GG 基因型 GAL5.1 活性很重要，但在 CA 基因型中则不那么重要。我们独特的研究采用了人类关联分析、小鼠 CRISPR 基因组编辑、动物行为分析和细胞培养研究的新组合，以确定一种高度保守的调节机制，该机制将焦虑和酒精摄入联系起来，这可能导致男性对焦虑和酒精滥用的敏感性增加。
theranostics是一种抗FAP-SCFV功能化的外泌体 -
理由：核（NP）纤维化是椎间盘变性（IVDD）的促成因素，该因素缺乏有效的治疗。这项研究的重点是阐明TGF-β信号阻遏物滑雪物在NP纤维化中的作用和机制，并探索其治疗潜力。方法：单细胞RNA测序（SCRNA-SEQ）用于研究纤维化核细胞细胞（NPC）亚群并评估TGF-β信号传导激活。将靶向纤维化NPC标记FAP和SKI mRNA的单链可变片段（SCFV）的两个重组质粒共转染到HEK-293T细胞中，以产生功能化的外泌体（EX SKI+SCFV）。将EX SKI+SCFV添加到明胶/氧化的藻酸钠水凝胶中产生了名为GEL@ex Ski+SCFV的pH响应外部/水凝胶系统。通过RNA测序，分子对接和共免疫沉淀评估了Gel@Ex Ski+SCFV的治疗效果和基础机制。结果：纤维化的NPC子集的特征是FAP升高和滑雪表达降低，以及TGF-β信号传导途径的激活。滑雪过表达降低了TGF-β处理的NPC中的纤维化。EX SKI+SCFV成功地将滑雪mRNA传递到表达FAP的纤维化NPC中。gel@ex Ski+SCFV具有良好的机械性能，可降解性，注射性和生物相容性。gel@ex Ski+SCFV有效地减轻了大鼠的NP纤维化和IVDD。RNA测序，分子对接和共免疫沉淀显示滑雪可以与FOXO3相互作用以抑制TGF-β信号通路。