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分析CRISPR介导的DNA裂解后基于NHEJ的DNA修复
摘要：使用CRISPR-CAS9核酸酶进行基因组编辑是基于DNA双重断裂（DSB）的修复。在真核细胞中，DSB通过同源指导的修复（HDR），非同源末端连接（NHEJ）或微学介导的终端连接（MMEJ）途径重新加入。其中，人们认为NHEJ途径是主导的，并且发生在整个细胞周期中。已知基于NHEJ的DSB维修是错误的；但是，很少有研究深入研究内源基因。在这里，我们通过掺入外源性DNA寡核苷酸来量化基于NHEJ的DSB修复精度（称为NHEJ精度）。通过对DSB发生后的外源性DNA和内源性靶点之间的连接序列的分析，我们确定NHEJ准确性的平均值在HEK 293T细胞中的最大值约为75％。在深入的分析中，我们发现NHEJ的精度依赖于序列，并且DSB端的近端邻近基序（PAM）的值相对较低，低于PAM远端的DSB。此外，我们观察到插入突变比与NHEJ准确性程度之间存在负相关。我们的发现将扩大对CAS9介导的基因组编辑的理解。
药物通过同伴网络扩散：...
在本节中，我们制定了一种替代性的经验策略来识别处方中的社会互动效果。遵循De Giorgi等人。（2010），我们使用同龄人的特征作为直接同龄人内源性行为的工具。由于共享患者的关系是非交往的，因此医生通常有同龄人也不是她的直接同龄人。存在这种“排除同龄人”的存在克服了曼斯基（Manski，1993）高点的反射问题，因为这一集合在连接的医师之间甚至有所不同。此外，在一定程度上，向医生的排除同伴支付的付款影响了直接同行的处方，此类付款可以提供一种工具，以识别直接PER处方对医生自身处方的影响。我们使用与第2节相同的符号。也就是说，医师的同龄人表示g i。我们进一步用E i表示，被排除在外的医师I的同龄人，被定义为所有与I共享同龄人但与I直接相关的医生。也就是说，e i = {k |∃j∈Gi g k和k̸∈Gi}。我们估计以下两阶段最小二乘模型：
健康与疾病中的小胶质细胞
• Fabp5 mediates lipid metabolism to drive microglia phenotype transition and neuroinflammation following stroke Yan Li • Senescent microglia conserved in aging and Alzheimer's disease exhibit elevated TREM2 protein levels Noa Rachmian • SorLA limits inflammatory properties of microglia during glioma progression Paulina Kaminska • Galectin-3 role in the小胶质细胞和淀粉样蛋白β的相互作用•小胶质细胞的多色命运图显示了缺血性中风后克隆膨胀，异质性和细胞 - 细胞相互作用。Majed Kikhia•纤维淀粉样蛋白-Beta诱导细胞应激，并改变小胶质细胞中的蛋白质降解Alison Carlisle•一种体外平台，通过与毒素性雌雄同体的血管构成血管化的脑巨噬细胞来产生人脑巨噬细胞。Amin Yarmand•神经胶质瘤中的小胶质细胞动力学：一种鉴定与疾病相关的小胶质细胞Jiawen Qian的命运映射方法•通过CSF1R操纵单核吞噬系统，以了解内源机制和增强后创伤和增强。
顺式调控变异影响基因表达动态......
摘要 顺式调控序列的进化取决于它们如何影响基因表达，并促使人们识别和预测导致物种内和物种间表达差异的顺式调控变体。虽然在将顺式调控变体与表达水平联系起来方面取得了很大进展，但基因激活和抑制的时间对顺式调控序列的进化也可能很重要。我们研究了双生期转变期间酵母菌物种内和物种间的等位基因特异性表达 (ASE) 动态，发现基因表达动态中存在明显的顺式作用变化。物种内 ASE 与基因间变体相关，ASE 动态与插入和缺失的关联性比与 ASE 水平的关联性更强。为了完善这些关联，我们使用高通量报告基因检测来测试启动子区域和单个变体。在重现内源表达的区域子集中，我们识别并表征了影响表达动态的顺式调控变体。在不同物种之间，嵌合启动子区会产生新的模式，并表明基因表达动力学的进化受到限制。我们得出结论，顺式调控序列的变化可以调节基因表达动力学，而表达动力学与表达其他方面之间的相互作用与顺式调控序列的进化有关。
在哺乳动物干细胞中利用通用供体进行高效、快速的荧光蛋白敲入
摘要 荧光蛋白 (FP) 标记是细胞生物学的基础方法，因为它可以观察活细胞中的蛋白质分布、动态和与其他蛋白质的相互作用。然而，使用标记蛋白过表达的典型方法可能会扰乱细胞行为并引入定位伪影。为了保持天然表达，可以将荧光蛋白直接插入内源基因中。这种方法在酵母中已经是标准做法几十年了，最近随着 CRISPR/Cas9 的出现，在无脊椎动物模型生物中也成为标准做法。然而，由于同源定向修复 (HDR) 效率低下，内源荧光蛋白标记尚未在哺乳动物细胞中广泛使用。在这里，我们描述了一种简化的方法，用于通过小鼠胚胎干细胞中的非同源末端连接 (NHEJ) 将 FP 标签高效快速地整合到天然基因座中。我们的方案最大限度地减少了使用通用供体的克隆，允许对内源蛋白进行 N 端或 C 端标记，并且从转染到成像只需不到 2 周的时间，从而提高了 FP 敲入在哺乳动物细胞中的适用性。简介荧光蛋白（FP）敲入能够实现内源性标记，从而实现蛋白质可视化，而不会产生过表达伪影1。敲入策略可以让研究人员准确观察和测量活细胞中蛋白质表达、定位和相互作用的动态。自20世纪90年代以来，FP敲入一直是酵母中的标准做法，因为这种生物可以通过同源重组有效地整合FP供体2,3。最近，由于CRISPR/Cas9技术的出现10，FP敲入已在秀丽隐杆线虫4-7和果蝇8,9中得到广泛采用。当由单向导RNA（sgRNA）编程时，Cas9会引入靶向的DNA双链断裂（DSB），细胞可以通过同源定向修复（HDR）或非同源末端连接（NHEJ）11进行修复。HDR因其高保真度而受到青睐12-15。然而，HDR 仅在某些细胞周期阶段 16 活跃，并且需要与靶标匹配的同源臂。因此，基于 HDR 的标记效率要低得多 17,18，并且需要在哺乳动物细胞中费力地克隆。为了规避这些限制，最近已引入 NHEJ 来在哺乳动物细胞中进行 FP 敲入 18–26 。一种名为 CRISPR 辅助插入标记 (CRISPaint) 22 的方法特别精简，因为它使用通用供体质粒，因此唯一需要的克隆是构建基因特异性 sgRNA。供体质粒通过转染引入细胞，与靶基因并行被 Cas9 切割，并通过 NHEJ 以非序列特异性的方式整合到靶基因中。为了允许使用任何基因特异性 sgRNA 同时保持正确的阅读框架，CRISPaint 使用通用的“框架选择器”在三种可能的阅读框架之一中切割通用供体 22 。尽管有这些优势，到目前为止，CRISPaint 仅在少数细胞系中进行了测试。此外，目前形式的 CRISPaint 系统仅可进行 C 端插入，这限制了其应用于蛋白质产物可耐受 C 端标记的基因。在这里，我们描述了一种基于 CRISPaint 的改进方法，该方法可在哺乳动物细胞中灵活、快速地在基因的任一端进行 FP 标记。我们的方法高效，需要的克隆最少，并且可以产生在天然调控元件的控制下表达的功能性内源性标记蛋白。我们在小鼠胚胎干细胞 (mESC) 中测试并优化了这种方法。我们在第一次尝试中成功标记了 5/5 个目标，从转染到成像的时间只有 2 周。此外，我们还构建了一组用于多色标记的质粒。总之，这些进展将促进 mESC 和其他哺乳动物细胞中的细胞生物学研究，并可能提供更快、更简单的快速创建敲入小鼠的途径。
病毒诱导的基因沉默 (VIGS)
摘要：病毒诱导的基因沉默（VIGS）是一种 RNA 介导的反向遗传学技术，现已发展成为分析基因功能不可或缺的方法。它利用植物的转录后基因沉默（PTGS）机制下调内源基因，以防止系统性病毒感染。根据最近的进展，VIGS 现在可以用作高通量工具，通过暂时抑制目标基因表达，通过病毒基因组在植物中诱导可遗传的表观遗传修饰。由于 VIGS 诱导的 DNA 甲基化进展，植物中正在开发具有所需性状的新型稳定基因型。在植物中，RNA 指导的 DNA 甲基化（RdDM）是一种机制，其中表观遗传修饰物由小 RNA 引导至目标位点，小 RNA 在靶基因的沉默中起主要作用。在这篇综述中，我们描述了 DNA 和 RNA 病毒载体的分子机制，以及通过改变研究植物中通常无法通过转基因技术获得的基因所获得的知识。我们展示了如何使用 VIGS 诱导的基因沉默来表征跨代基因功能和改变的表观遗传标记，从而改善未来的植物育种计划。
果蝇中异二聚化依赖的 BMP 分泌
摘要 组合信号是指导情境相关细胞行为的关键。在胚胎发育、成体稳态和疾病期间，骨形态发生蛋白 (BMP) 充当二聚体来指导特定的细胞反应。BMP 配体可以形成同二聚体或异二聚体；然而，获得每种形式的内源性定位和功能的直接证据已被证明具有挑战性。在这里，我们利用精确的基因组编辑和通过蛋白质结合剂进行的直接蛋白质操作来剖析果蝇翅成虫盘中 BMP 同二聚体和异二聚体的存在和功能相关性。这种方法原位揭示了 Dpp (BMP2/4)/Gbb (BMP5/6/7/8) 异二聚体的存在。我们发现，尽管 Gbb 由翅成虫盘的所有细胞产生，但仅由表达 Dpp 的细胞分泌。 Dpp 和 Gbb 形成异二聚体的梯度，而在内源性生理条件下，Dpp 和 Gbb 同二聚体均不明显。我们发现异二聚体的形成对于在发育中的翅膀中获得最佳信号传导和长距离 BMP 分布至关重要。这些结果表明 Dpp/Gbb 异二聚体是上皮模式形成和生长所需的活性信号。
内生生产网络和供应链中断
摘要：本文研究了生产网络的作用，并提供了有关供应冲击如何影响价格和生产力的因果估计。使用来自土耳其的独特公司级生产网络数据，土耳其是一个具有高通货膨胀和扩张性货币政策的国家，我通过利用中国供应商造成的破坏来隔离供应冲击。该研究发现，依靠中国进口的公司将其价格提高了11％，并且在供应链中断后的劳动生产率下降了24％。要探索潜在的机制，我进一步扩展了公司产品水平的分析，并发现对劳动生产率的影响主要是由中级和资本货物的进口驱动的。在这些经验发现的指导下，我建立了一个内源网络形成模型，在该模型中，企业的效率和供应商的效率是异质的。生产网络的内生性也起源于生产网络中的相互依存选择。本文提供了新的牢固异质性作为供应链选择。最后，我校准了模型，以分析模拟中断在公司供应链中的含义。反事实供应链带有干扰，转化为总价格上涨，同时将进口商从中国供应商转移到其他供应商。
夏季本科 - 研究会议
几乎所有生物（从细菌到人类）都表现出昼夜节律。生物的这种基本特性是一个内源过程，可在24小时内控制生理和行为。据说生物（昼夜节律）时钟是由特定基因的周期性表达产生的。在丝状真菌神经孢子虫中，FRQ，WC-1和WC-2基因认为对昼夜节律振荡器至关重要。表达这些基因时，它们的蛋白质产物在研究良好的转录反馈回路（TTFL）中相互作用。重要的是，当反馈循环被破坏时，在某些条件下仍然可以看到节奏性。这表明存在无FRQ的振荡器（FLO）。我们旨在识别FLO的组成部分以及它们如何与已知的TTFL相互作用。采用标准遗传技术，我将不同的时钟引入了一个真菌菌株，其中许多代码用于TOR的成分（雷帕霉素）营养感应途径。这些突变的真菌菌株将用于研究TOR途径，作为FLO的潜在至关重要的成分。这项研究有望提供有机体如何讲述时间的宝贵见解，并有助于加深我们对人类偶然过程的理解，包括睡眠，代谢和免疫功能。
通过Moontag可编程转录激活剂在植物中有效的基因激活
CRISPR/CAS基于转录激活剂已被开发以诱导真核和原核生物中的基因表达。基于CRISPR-CAS的系统的主要优点是它们可以实现高水平的转录激活，并且可以通过对指导RNA和DNA靶链之间的配对来易于编程。Suntag是第二代系统，通过向目标启动子募集多个活化域（AD）的多个副本来激活转录。Suntag是强大的激活剂；但是，在某些物种中，很难稳定表达。为了克服这个问题，我们设计了一种新的激活剂，它以与Suntag相同的基本原理工作，但是当在转基因植物中稳定表达时，其成分的耐受性更好。我们证明了Moontag能够在所有测试的植物中诱导高水平的转录。在Setaria中，Moontag能够诱导报告基因和内源基因的高转录。更重要的是，Moontag成分在转基因植物中表达高水平，而没有任何有害的效果。Moontag还能够有效地激活拟南芥和番茄等属性物种中的基因。最后，我们表明，Moontag激活在一系列温度下起作用，这对于潜在的场应用有望。