最近的可自定义核酸内切酶的出现导致了基因工程的显着进步,因为这些分子剪刀允许靶向引入突变,甚至可以精确预定义的遗传修饰到几乎任何选择的基因组目标位点。由于其前所未有的精确性,有效性和功能多功能性,这种通常称为基因组编辑的技术不仅在致力于阐明基因功能的基础研究中,而且是基于知识的作物特征的改善,也已成为有效的力量。在当前可用于定位基因组修饰的不同平台中,RNA引导的定期间隔短的短质体重复序列(CRISPR)相关(CAS)核酸内切核酸杆菌已被证明是最强大的。本评论提供了一个面向应用程序的概述,概述了可定制的核酸内切酶的开发,当前的谷物作物育种方法以及该领域的未来机会。
今天,我们正在经历剪刀效应。得益于城市转型和每平方米的合理化,生态实用性促使我们以不同的方式安排事物,利用现有资源。然而,常识告诉我们应该停止建造新建筑,但人口压力和移民趋势正促使我们建造更多的住房,以便与越来越多的人和用途共存。此外,世界正在经历的健康危机正在影响城市规划和人们的生活方式。在政府宣布封锁后,数千平方米的办公空间空置了几个月,法国人的客厅变成了开放空间。许多地方当局、协会和公司组织起来征用通常使用者废弃的建筑物,以便将其提供给有需要的人。这些模型更适合当代的生活方式,可以想象它们会持续存在。如果明天客厅可以改造成会议室,那会怎样?如果明天每一平方米的空置,无论是几个小时还是几年,都可以重新分配,从而满足以前不存在或被忽视的用途或需求,那会怎样?
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CRISPR 技术有两个基本生物学组成部分(图 1)。2 第一组组成部分是称为 CRISPR 相关蛋白 (Cas) 的蛋白质,其功能如同分子剪刀,可启动 DNA 的双链断裂。第二组组成部分是向导 RNA,由两部分组成:CRISPR RNA (crRNA) 和反式激活 CRISPR RNA (tracrRNA)。向导 RNA 会瞄准 DNA 上 Cas 进行断裂的确切位点。CRISPR 介导的编辑机制主要有三种类型,可产生基因操作。首先,CRISPR 可在 DNA 中造成单次切割,破坏原始 DNA 序列并导致基因失活。其次,可以使用两个向导 RNA 删除较大的 DNA 片段。在每个 DNA 位点进行切割后,细胞修复过程会将剩余 DNA 片段的不同末端连接起来。第三,可以将 DNA 模板添加到 CRISPR 机制中,使细胞能够纠正基因,甚至插入新基因。
基因组编辑是一种在基因组中特定位置生成 DNA 序列变体的技术。这可以发生在蛋白质的编码区,从而影响其功能,也可以发生在启动子区,从而影响细胞类型特异性或启动子活性的时间。基因组编辑工具箱中最著名的系统是 CRISPR/Cas9,基因剪刀的发明者 Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer Doudna 因该系统获得了 2020 年诺贝尔奖 2 。替代系统是转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN) 或锌指核酸酶 (ZFN)。所有这些编辑工具都以基因组中的特定序列为目标,并在目标位点诱导 DNA 双链断裂。一旦 DNA 被切断,细胞就会使用自己的 DNA 修复机制,包括几乎所有细胞类型和生物体中发生的两种主要机制:同源定向修复 (HDR) 和非同源末端连接 (NHEJ),分别导致靶向整合或基因破坏 3 。
今天,我们正在经历剪刀效应。得益于城市改造和每平方米的合理化,生态实用性迫使我们以不同的方式安排事物,利用现有资源。然而,常识告诉我们应该停止建造新建筑,但人口压力和移民趋势正促使我们建造更多的住房,以便与越来越多的人和用途共存。此外,世界正在经历的健康危机正在影响城市规划和人们的生活方式。在政府宣布封锁后,数千平方米的办公空间空置了几个月,法国人的客厅变成了开放空间。许多地方当局、协会和公司组织起来征用通常使用者遗弃的建筑物,以便将其提供给需要它们的人。这些模式更适合当代的生活方式,可以想象会持续下去。如果明天,客厅被想象成会议室,那会怎样?如果明天,每一平方米的空置,无论是几个小时还是几年,都可以重新分配,从而满足以前不存在或被忽视的用途或需求,那会怎样?
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图3。暴露于扁平的钳子上拉紧脖子背面的皮肤,并用钝的钳子放置剪刀,以使第一次切割,并参考步骤19“暴露于Cisterna Magna”'。(b)第一次切割后,在皮肤下露出组织,您应该在中间看到一条白色条纹,参考步骤19“暴露于cisterna magna”。(c – e),参考步骤20“暴露于Cisterna Magna”''的第一层肌肉。(f)使用钝的牵开器从头骨上拉开肌肉,在Cisterna Magna上方露出一层薄薄的肌肉,参考步骤21“暴露于Cisterna Magna”。(g – i)使用“挖掘”运动用钝头露出甲壳虫。在面板I中,倒三角形代表应为CSF收集刺穿Cisterna Magna的区域。比例尺表示100 m m。避免所有血管降低用血液污染CSF的风险,参考步骤22“暴露Cisterna Magna”。
基因组编辑涉及使用定位的核酸酶(例如锌指核酸酶,Talens或CRISPR/CAS9)切割DNA双螺旋,并在基因组DNA中的靶向,特定序列引入双链断裂(DSB)。实际上是一对成熟的分子剪刀。然后,使用两种机制之一,通过细胞中的机械修复DSB。一种方法是非同源末端连接(NHEJ),其中两个破裂的末端彼此并排并粘合在一起。此方法容易出错,并且由于维修过程中不可避免的错误,在目标裂解位点会导致目标切割部位的插入和缺失(Indels)。这些误差会改变核酸酶目标位点,并防止进一步的切割事件,并通常禁用或敲除基因功能。另一种修复机制是使用同源核酸修复模板的同源指导修复(HDR)。修复模板可以设计与DSB两侧匹配的同源性区域之间进行所需的修改。这可用于引入一系列基因组编辑,从点突变到全基因插入。