1 印第安纳医学院儿科、解剖学、医学和分子遗传学系 Herman B Wells 儿科研究中心,美国印第安纳州印第安纳波利斯 46202 2 印第安纳大学基因组学和生物信息学中心,美国布卢明顿 3 劳伦斯伯克利国家实验室环境基因组学和系统生物学部,美国加利福尼亚州伯克利 94720 4 加利福尼亚大学比较生物化学项目,美国加利福尼亚州伯克利 94720。 5 美国能源部联合基因组研究所,劳伦斯伯克利国家实验室,美国加利福尼亚州伯克利 94720 6 伯尔尼大学生物医学研究系 (DBMR),瑞士伯尔尼 7 伯尔尼大学医院心脏病学系,瑞士伯尔尼
S. Sebastian Pineda, 1,2,3,4 Hyeseung Lee, 3 Maria J. Ulloa-Navas, 5 Raleigh M. Linville, 3,4 Francisco J. Garcia, 3,6 Kyriakitsa Galani, 2,4 Erica Engelberg-Cook, 5 Monica C. Castanedes, 5 Brent E. Fitzwalter, 3 Luc J. Pregent, 5 Mahammad E. Gardashli, 5迈克尔·德鲁尔(Michael Duck),5戴安娜·V·维拉·加西亚(Diana V. Vera-Garcia),5安德烈·T.S。Hucke,5 Bjorn E. Oskarsson,7 Melissa E. Murray,5 Dennis W. Dickson,5 Myriam Heiman,3,6,9, * Veronique V. Belzil,5,8, *和Manolis Kellis *和Manolis Kellis 1,2,4,1,2,4 *马萨诸塞州马萨诸塞州剑桥市的人工智能实验室,马萨诸塞州剑桥市02139,美国3科沃学习与记忆研究所,马萨诸塞州技术研究院,剑桥,马萨诸塞州剑桥市,美国马萨诸塞州02139,美国4美国麻省理工学院和哈佛大学研究所,哈佛大学,哈佛大学,坎布里奇,坎布里奇,马萨诸塞州坎布里奇,马萨诸塞州02141,美国5号部门,脑电图,302141,美国5号部门。马萨诸塞州科技研究所,马萨诸塞州剑桥市02139,美国7神经病学系Mayo Clinic,美国杰克逊维尔32224,美国8现在的地址:Vanderbilt大学医学中心,NASHVILLE,TN 37232,USA 9 LEAD CONCECTENCE conteracnence *socustract *socorlight *socutience *,),veronique.belzil@vumc.org(v.v.b。),manoli@mit.edu(M.K。)https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.02.031
●将细胞和质粒混合到预燃烧的(ICE)1毫米比色杯以进行电穿孔(例如),非常小心地避免气泡(如果需要时,可以避免使用气泡,以避免气泡,移液器<25 ul)。将比色杯保持在冰上。●电塑料(例如Biorad Gene脉冲器,2 kV,200 𝛀,25 UF)。点击比色杯以消除气泡,并先用吸收纸从比色杯中擦拭冰/水。时间常数应在4.0至4.3 ms范围内。短时常数带有火花,表明出现问题。如果发生这种情况,请重复,减少质粒的量并注意气泡。●成功进行电穿孔后,立即添加475 UL恢复介质(例如SOC),转移到1.5 ml管,并在37℃下摇动。●串行稀释电穿孔,板块在氨苄青霉素板上的转化为0.1%,以评估转化效率。●您可以将电穿孔的细胞保持在4C,直到确认高效率,也可以用氨苄青霉素在LB中过夜(通常在250毫升250 mL烧瓶中,37C,37C,轨道振荡器200 rpm)。●确认高效率后(您应该在0.1%板中看到> 1000个菌落,对应于1m> 1m的转化剂),制作甘油库存以备将来使用,并通过mini或MIDI Prep纯化质粒或MIDI PREP,适用于下游克隆
1型糖尿病(T1D)是一种自身免疫性疾病,其特征是胰腺中产生胰岛素的B细胞。这种破坏会导致慢性高血糖,因此需要终身胰岛素治疗来管理血糖水平。通常在儿童和年轻人中被诊断出,T1D可以在任何年龄段发生。正在进行的研究旨在揭示T1D潜在的确切机制并开发潜在的干预措施。其中包括调节免疫系统,再生B细胞并创建高级胰岛素输送系统的努力。新兴疗法,例如闭环胰岛素泵,干细胞衍生的B细胞替代和疾病改良疗法(DMTS),为改善T1D患者的生活质量并有潜在地朝着治疗方向前进。目前,尚未批准用于第3阶段T1D的疾病改良疗法。在第3阶段中保留B -cell功能与更好的临床结局有关,包括较低的HBA1C和降低低血糖,神经病和视网膜病的风险。肿瘤坏死因子α(TNF-A)抑制剂在三阶段T1D患者的两项临床试验中,通过测量C肽来保存B细胞功能,证明了效率。然而,在T1D的关键试验中尚未评估TNF-A抑制剂。解决T1D中TNF-A抑制剂的有希望的临床发现,突破T1D召集了一个主要意见领导者(KOLS)的小组。研讨会
1。简介4 1.1。协议正时4 1.2。PipSeq平台概述5 1.2.1。pipseq v t10 3ʹ捕获和条形码套件5 1.2.2。PIPSEQ V通用入门设备套件6 1.2.3。pipseq v t10 3ʹ捕获和条形码消耗品套件6 1.2.4。PIPSEQ V T10 3 capture&Barcoding环境套件7 1.2.5。pipseq v t10 3ʹ捕获和条形码-20℃套件7 1.2.6。PIPSEQ V T10 3 capture&Barcoding -80℃套件7 1.2.7。PIPSEQ V库准备套件8 1.2.8。PIPSEQ V库准备环境套件8 1.2.9。pipseq v库准备-20℃套件8 1.3。第三方试剂,设备和消耗量要求8 1.3.1所需的第三方试剂8 1.3.2所需的第三方消耗量9 1.3.3。所需的第三方设备10 1.3.4。PIPSEQ兼容替代RNase抑制剂10 1.4协议注释指南11 2。最佳实践11 2.1。使用RNA 11 2.2。使用PCR产品12 2.3。离心步骤12 2.4。热环状盖压力13 2.5。单元格载13 3.Pipseq设备准备13 3.1。PipSeq Vortexer操作13 3.2。Pipseq干浴操作14 3.2.1。Pipseq Dry Bath 14 3.2.2。Pipseq干浴盖设置和控制14 3.2.3。Pipseq Dry Bath Control 15 3.2.4。pipseq干浴协议16 4。样品制备17 4.1。细胞制备17 4.1.1与固定细胞一起工作19 4.2。核制剂20 4.2.1。核分离20 4.2.2。使用固定核21 4.2.3。核悬浮缓冲液制备21 5。PIPSEQ V T10协议22 5.1。捕获和裂解22
单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 是一种相对较新的技术,它通过描述单个细胞之间的转录组差异,提供了前所未有的细胞异质性和功能详细视图。这将允许在生理和病理过程中映射细胞类型特异性信号,从而在现有的许多离散簇之间建立高度特异性的细胞信号网络模型。因此,该技术提供了一种强大的方法来剖析导致自身免疫性疾病(包括类风湿性关节炎 (RA))的细胞和分子机制。scRNA-seq 可以提供有关 RA 独特细胞状态和转变的宝贵见解,有可能开发新的药物靶点。然而,一些挑战仍然限制了它的主流应用,包括成本较高、对低丰度转录本的灵敏度较低以及与批量或传统 RNA 测序相比相对复杂的数据分析工作流程。这篇小评论探讨了 scRNA-seq 在 RA 研究中新兴的应用,强调了其在产生重要见解方面的作用,这些见解有助于为创新和更有效的治疗策略铺平道路。
AmbientContribMaximum。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。2环境。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。5 AmbientContribsParse。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。8 Ambient -ProfileBimodal。。。。。。。。。。。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>10个环境回复融化。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>11个barcoderanks。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 14个嵌合龙。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div> 。 div>11个barcoderanks。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>14个嵌合龙。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>17个清洁量。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>19 defaultDrops。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>21个倒影器。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。23个空滴定。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。25个kenumyDropsCellranger。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。30 engodesequences。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。33 GET10xmolinFostats。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。34个hasheddrops。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。35 makecountmatrix。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>40个read10xCounts。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>42 read10xmolinfo。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>45个重新效果。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。 div>。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。47 removeAmbience。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。48个交换。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。50 write10xcounts。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。53
结直肠癌(CRC)是一种流行的恶性肿瘤,其特征是全球发病率和死亡率高。此外,必须理解其发育发展的分子机制并确定有效的预后标记。这些努力对于确定潜在的治疗靶标和提高患者存活率至关重要。因此,我们开发了一种新型的预后模型,旨在为临床预后评估和治疗提供新的理论支持。我们从基因表达综合(GEO)和癌症基因组图集(TCGA)数据库中下载了数据。随后,我们进行了单细胞分析,并开发了与结直肠癌相关的预后模型。我们将SCRNA-SEQ数据集(GSE221575)分为19个细胞簇,并使用标记基因将这些簇分为11种不同的细胞类型。使用单变量COX回归和拉索(绝对收缩和选择算子)分析,我们开发了一个由9个基因组成的预后模型。基于我们的9基因模型,我们使用中位风险评分将患者分为高风险和低风险组。高危组表现出与M0巨噬细胞,CD8+ T细胞和M2巨噬细胞的显着正相关。富集分析表明,高风险基团的免疫相关途径的显着富集,包括刺猬_signaling,Wnt信号通路和细胞粘附分子。药物敏感性分析表明,低风险组对5种化学治疗药物敏感,而高风险组仅对1个。此外,我们为临床应用开发了高度可靠的列图。这表明我们的建模分析得出的风险评分对于分层结直肠癌样本非常有效。这项研究全面应用生物信息学方法来构建风险评分模型。该模型显示出良好的预测性能,为结直肠癌患者的个性化治疗提供了潜在的指导。此外,它可以为疾病的发病机理提供有价值的见解,并确定潜在的治疗靶点以进行进一步研究。
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在胚胎发育过程中,细胞将分化为高度专业的细胞类型。利用单细胞RNA测序,已经投入了大量资源,以通过其跨性别的pro文件来分类这些差异化的细胞类型。尽管为涉及杂货器官及其细胞组成而做出了广泛的努力,但我们缺乏评估测序项目完整性的指标。在这种细胞生物多样性分析中,我们利用了日益获得的单细胞数据以及统计方法,原始开发了用于评估生态群落的物种丰富性,以估计基于单细胞填充技术的数据的任何ORGAN的细胞多样性。从这种细胞丰富度估计中,我们建立了一个统计框架,可以评估任何大型单细胞专业填充项目的完整框架,此后,其他的测序工作不再揭示出对器官细胞组成的新信息。这种估计值可以作为正在进行的单细胞测序项目的停止点,因此指导对各种人体组织的pro填充的成本更明确。