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World File Search System原代
人原代T细胞基因组编辑
（ A ）使用ImmunoCult™ 人 CD3 / CD28 或 CD3 / CD28 / CD2 T 细胞激活活化剂人 T 2 - 3 天后，通过将 TCR αβ 和 CD3 受体与抗体结合，进行流式分析，来测定 TRAC 的敲除效率。每个条件的每个数据点代表一个单独的供体；n = 4 - 8 个供体。每一列线路表示干±标准差。（ B ） ）首先人T细胞被ImmunoCult™人CD3 / CD28 T细胞剂激活活化剂3天，然后进行电转。在电转48小时后，通过ArciTect™ T7循环内切酶I试剂盒测定基因组编辑（切割）的效率。 RNP 电转：+ RNP 。（ C - D ）被ImmunoCult™ 人 CD3 / CD28 T 细细胞激活剂活化 3 天的人 T 细胞经（ C ）模拟电转（无 RNP ）和（ D ） RNP 电转后 TCR αβ 和 CD3 的流式分析点图。（ E ）被ImmunoCult™ 人 CD3 / CD28 T 细胞激活剂活化 3 天的人 T细胞的CD4和CD8流式分析点图。
基于 RNP 的原代 CD4+T 细胞编辑...
电穿孔后 72 小时，可使用 BioLegend APC 抗人 TCR α / β 抗体通过流式细胞术评估用靶向 Edit-R sgRNA RNP 的 TRAC 或 TRBC 编辑的原代 CD4 + T 细胞的 TCR α / β 敲除情况。除了通过流式细胞术读取表型外，在基于 RNP 的编辑后 48-72 小时内，可以通过 T7EI/TIDE 测量插入/缺失形成。使用表 1 中列出的每个经过验证的 sgRNA 的引物，遵循 Dharmacon™ Edit-R™ 合成 gRNA 阳性对照试剂盒方案中的直接细胞裂解和 PCR 条件。要测量 T7EI 内切酶的插入/缺失形成，请完成上面列出的方案并使用分析软件。要通过分解 (TIDE) 分析跟踪插入/缺失来测量插入/缺失形成，请将得到的 PCR 扩增子发送至 Sanger 测序并使用网络工具，例如 http://shinyapps.datacurators.nl/tide/ 。以下方案描述了用于通过流式细胞术评估原代 CD4 + T 细胞中 TCR α / β 表型敲除的染色条件。1. 通过离心（300-5 分钟）沉淀用 PPIB、NTC2、TRAC 或 TRBC 靶向 RNP 电穿孔的 CD4 + T 细胞
开发-嵌合抗原受体-原代-人类-...
基因工程是推动免疫疗法发展的主要驱动力，而过继免疫疗法是一种很有前途的癌症治疗方法。由于 NK 细胞具有强大的抗肿瘤特性，并且在同种异体环境中具有已证实的安全性，因此在免疫肿瘤学中对原代人类自然杀伤 (NK) 细胞进行工程改造具有巨大的前景。NK 细胞和 T 细胞是临床试验中常用的细胞类型，因为它们能够识别和摧毁恶性细胞。NK 细胞不依赖匹配的人类白细胞抗原来发挥作用，从而保护同种异体转移免受移植物抗宿主病的影响。因此，它们有可能比目前的工程化 T 细胞疗法更安全、更有效。NK 细胞治疗领域的一个关键挑战是如何使用可以支持监管备案的试剂和仪器来利用扩增、修改和处理临床相关数量的 NK 细胞的能力。在这里，我们开始解决这个痛点。
对人类原代自然杀伤细胞的基因操作......
淋巴结外自然杀伤 (NK)/T 细胞淋巴瘤，鼻型 (ENKTCL) 是一种高度侵袭性的淋巴瘤，其中肿瘤抑制基因 PRDM1 经常丢失或失活。我们采用了两种不同的 CRISPR/Cas9 方法来生成 PRDM1 -/- 原代 NK 细胞，以研究该基因在 NK 细胞稳态中的作用。与野生型相比，PRDM1 -/- NK 细胞的克隆效率显著提高、增殖率更高、凋亡更少。基因表达谱显示，在 PRDM1 -/- NK 细胞中，与增殖、细胞周期、MYC、MYB 和 TCR/NK 信号相关的通路显著富集，但与正常细胞功能（包括细胞毒功能）相关的通路被下调，这表明 PRDM1 的缺失使 NK 细胞转向增殖和存活，而不是发挥其正常功能。我们还能够进一步修改 PRDM1 缺失的克隆，以引入 ENKTCL 中常见的肿瘤抑制基因（如 TP53、DDX3X 和 PTPN6）的杂合缺失。我们建立了体外模型来阐明 PRDM1 介导其对 NK 细胞的稳态控制的主要途径。这种方法可以应用于研究淋巴瘤发病机制中的其他相关遗传病变和致癌协同作用。
基于 CRISPR 的原代 T 细胞基因编辑面临的挑战
摘要：自适应 T 细胞免疫疗法有望成功治疗白血病以及其他类型的癌症。最近，它还被证明是治疗免疫抑制患者慢性病毒感染的有效选择。用于免疫治疗的自体或同种异体 T 细胞通常经过基因改造以表达新的 T 细胞或嵌合抗原受体。使用 CRISPR/Cas 系统可以大大简化此类细胞的产生，从而可以在基因组内的特定位置删除或插入新基因。在这篇综述中，我们描述了最近对这些基因改造至关重要的方法学突破，总结了进行此类实验时需要考虑的关键点，并强调了这些方法的潜在缺陷。
将Bcl-2作为原代P210BCR-ABL1阳性B-ALL细胞的治疗策略
摘要。背景/目标：费城阳性急性淋巴细胞白血病（pH + b-all）是由由BCR-ABL1本质催化活性诱导的淋巴样细胞的恶性转化引起的。BCR-ABL1酪氨酸激酶抑制剂（TKI）对慢性髓样白血病（CML）细胞有效，可诱导耐用的血液学，细胞遗传学和分子反应。然而，在pH + b -all中 - 如CML爆炸危机 - TKI无法维持疾病的缓解。因此，我们想研究BCl-2和BCR-ABL1的双重靶向是否在杀死PH + B-ALL细胞方面更有效。材料和方法：使用Venetoclax，单独或与BCR-ABL1抑制结合使用P210-B-ALL CD34阳性细胞评估BCR-ABL的表达和BCl-2的药理靶向。结果：我们证明了Bcl-2抑制作用的细胞毒性效应，以及用Venetoclax和Nilotinib对Bcl-2和BCR-ABL1的双重靶向进一步提高了这种细胞毒性。结论：Bcl-2是原发性pH + B-所有细胞及其抑制作用的关键生存因子 - 单独或与BCR-ABL1 TKI结合使用 - 应作为这些患者的潜在治疗策略。
自体和同种异体人类原代胆管细胞器官的免疫原性
预印本（未通过同行评审认证）是作者/资助者。保留所有权利。未经许可就不允许重复使用。此版本的版权持有人于2024年1月14日发布。 https://doi.org/10.1101/2024.01.11.574744 doi：biorxiv Preprint
mRNA 介导的基因编辑工具向人类原代肌肉干细胞递送
肌营养不良症是约 50 种毁灭性的、无法治愈的单基因疾病，会导致进行性肌肉退化和萎缩。使用基于 CRISPR/Cas9 的工具对可移植细胞进行基因校正是自体细胞替代疗法恢复许多遗传疾病器官功能的现实方案。然而，肌肉干细胞迄今为止一直落后，因为缺乏分离和繁殖它们的方法，而且它们易受大量离体操作的影响。在这里，我们展示了基于 mRNA 的 SpCas9 和腺嘌呤碱基编辑器的递送，可在来自许多捐赠者的人类肌肉干细胞中实现高达 90% 以上的基因组编辑效率，无论年龄和性别如何，并且无需任何富集步骤。使用 NCAM1 作为所有肌肉干细胞表达的内源性报告基因座，并且其敲除不会影响细胞适应性，我们表明用 mRNA 编辑的细胞完全保留了其成肌标记特征、增殖能力和功能属性。此外，基于 mRNA 的碱基编辑器递送可在单个无选择步骤中高效修复导致肌肉萎缩的 SGCA 突变。总之，我们的工作确立了基于 CRISPR/Cas9 的工具的 mRNA 介导递送是一种有前途且通用的方法，可将基因编辑的肌肉干细胞用于临床治疗肌肉疾病。