- 本课程的一个目标是让您熟悉现代应用微观经济学论文中使用的实证方法。在每节课结束时,我将在接下来的一周介绍一篇论文中使用的一种方法的基础知识。目标是让您为更批判性、更深入地参与论文做好准备。我还可能简要介绍下一周的材料以及阅读这些论文/思考批评和扩展时应该考虑的问题类型。
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将打靶特定人源基因的 Cas9 和 sgRNA 转染到 HEK293 细胞。转染所用的质粒 DNA 上含有 表达带双端核定位序列 ( NLS )的 Cas9 及 sgRNA 的表达框,通过 TransIT-X2 (Mirus) 转染 试剂进行转染。转染所用的 Cas9 mRNA 进行了假尿苷和 5- 甲基胞嘧啶修饰且带有双端 核定位序列,使用 transIT-mRNA 转染试剂将 sgRNA 和 mRNA 共转染。 Cas9 RNPs 使用脂质 体 RNAiMAX ( Life Technologies ) 进行反向转染, RNP 的终浓度为 10 nmol 。 Cas9 蛋白上不含 核定位序列。 EnGen Cas9 含有双端核定位序列。编辑效率通过 T7E1 实验进行分析,结果 以修饰百分比进行统计。
将打靶特定人源基因的 Cas9 和 sgRNA 转染到 HEK293 细胞。转染所用的质粒 DNA 上含有 表达带双端核定位序列 ( NLS )的 Cas9 及 sgRNA 的表达框,通过 TransIT-X2 (Mirus) 转染 试剂进行转染。转染所用的 Cas9 mRNA 进行了假尿苷和 5- 甲基胞嘧啶修饰且带有双端 核定位序列,使用 transIT-mRNA 转染试剂将 sgRNA 和 mRNA 共转染。 Cas9 RNPs 使用脂质 体 RNAiMAX ( Life Technologies ) 进行反向转染, RNP 的终浓度为 10 nmol 。 Cas9 蛋白上不含 核定位序列。 EnGen Cas9 含有双端核定位序列。编辑效率通过 T7E1 实验进行分析,结果 以修饰百分比进行统计。
时序基准发生器是一个 8 级递增计数器 , 可以精确的产生时基。看门狗 ( WDT )是由一个 时基发生器和一个 2 级计数器组成,它可以在主控制器 或其它子系统处于异常状态时产生中断。 WDT 计数溢出时产生一个溢出标 志,此标志可以通过命令输出到 /IRQ 脚 ( 开漏输出 ) 。时序基准发生器和 WDT 时钟的来源。时基和看门狗共用 1 个时钟源,可配置 8 种频率: f WDT = f sys/2 n ( n=0~7 )
mRho hRHO/+ 小鼠注射了双 AAV 系统,其中以不同的载体 1:载体 2 比例识别出领先的 gRNA 59,并在注射后 6 周进行分析(载体 n=12;gRNA 59 n=20–22)。显示平均值 (SD)。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001 vs 载体。# p<0.05、## p<0.01、#### p<0.0001 vs 其它载体比例。(A) 编辑标准化为转导区域。黑色虚线表示达到治疗相关编辑水平 (≥25%) 的阈值。3 (B) gRNA 水平。(C) Cas9 mRNA 水平。(D) 内源性 hRHO mRNA 水平。数据标签表示与载体相比的百分比下降。(E) 外源性替代 coRHO mRNA 水平。数据标签表示与载体相比的倍数增加。AAV,腺相关病毒;bp,碱基对;coRHO,密码子优化的RHO等位基因;gRNA,向导RNA;hRHO,人类RHO等位基因;mRho,小鼠Rho等位基因;NGS,下一代测序;RHO/Rho,视紫红质;SD,标准差。