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World File Search System双足
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将打靶特定人源基因的 Cas9 和 sgRNA 转染到 HEK293 细胞。转染所用的质粒 DNA 上含有 表达带双端核定位序列 （ NLS ）的 Cas9 及 sgRNA 的表达框，通过 TransIT-X2 (Mirus) 转染 试剂进行转染。转染所用的 Cas9 mRNA 进行了假尿苷和 5- 甲基胞嘧啶修饰且带有双端 核定位序列，使用 transIT-mRNA 转染试剂将 sgRNA 和 mRNA 共转染。 Cas9 RNPs 使用脂质 体 RNAiMAX ( Life Technologies ) 进行反向转染， RNP 的终浓度为 10 nmol 。 Cas9 蛋白上不含 核定位序列。 EnGen Cas9 含有双端核定位序列。编辑效率通过 T7E1 实验进行分析，结果 以修饰百分比进行统计。
利用 CRISPR-Cas9 创建白化鱿鱼品系及其在神经活动体内功能成像中的应用
头足类动物在无脊椎动物中以认知能力、适应性伪装、新颖结构和通过 RNA 编辑重新编码蛋白质的倾向而引人注目。然而，由于缺乏遗传上可处理的头足类模型，这些创新背后的机制尚不清楚。CRISPR-Cas9 等基因组编辑工具允许在不同物种中进行定向突变，以更好地将基因和功能联系起来。一种新兴的头足类模型 Euprymna berryi 产生大量胚胎，这些胚胎可以在其整个生命周期中轻松饲养，并且具有已测序的基因组。作为原理证明，我们在 E. berryi 中使用 CRISPR-Cas9 来靶向色氨酸 2,3 双加氧酶 (TDO) 基因，色氨酸 2,3 双加氧酶 (TDO) 是形成色素色素所需的酶，色素色素是头足类动物眼睛和色素细胞中的色素。将靶向 tdo 的 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白注射到早期胚胎中，然后培养至成年。出乎意料的是，注射的标本是有色的，尽管通过对注射动物 (G0s) 进行测序验证了目标位点的插入缺失。经过多代繁殖的 TDO 纯合敲除系也有色。令人惊讶的是，E. berryi 中也存在编码吲哚胺 2,3 双加氧酶 (IDO) 的基因，该酶在脊椎动物中催化与 TDO 相同的反应。使用 CRISPR-Cas9 对 tdo 和 ido 进行双敲除产生了白化表型。我们展示了这些白化病在双光子显微镜对大脑中的 Ca 2+ 信号进行体内成像中的实用性。这些数据表明，制造基因敲除头足类动物系的可行性，可用于对这些行为复杂的生物体的神经活动进行实时成像。
基于双 AAV CRISPR-Cas9 的“...
mRho hRHO/+ 小鼠注射了双 AAV 系统，其中以不同的载体 1：载体 2 比例识别出领先的 gRNA 59，并在注射后 6 周进行分析（载体 n=12；gRNA 59 n=20–22）。显示平均值 (SD)。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001 vs 载体。# p<0.05、## p<0.01、#### p<0.0001 vs 其它载体比例。(A) 编辑标准化为转导区域。黑色虚线表示达到治疗相关编辑水平 (≥25%) 的阈值。3 (B) gRNA 水平。(C) Cas9 mRNA 水平。(D) 内源性 hRHO mRNA 水平。数据标签表示与载体相比的百分比下降。(E) 外源性替代 coRHO mRNA 水平。数据标签表示与载体相比的倍数增加。AAV，腺相关病毒；bp，碱基对；coRHO，密码子优化的RHO等位基因；gRNA，向导RNA；hRHO，人类RHO等位基因；mRho，小鼠Rho等位基因；NGS，下一代测序；RHO/Rho，视紫红质；SD，标准差。
明尼苏达州双港市
减少通过港口的散装商品，这些商品每年可产生 118 亿美元的营业收入，并支持 60,795 个工作岗位，这些岗位每年可为运输和商品相关行业带来超过 2.9 亿美元的个人收入 如果港口禁止商业交通，商品将不得不通过铁路和卡车运输。这将使每年的有害颗粒物 (PM-10) 排放量增加超过 1.339 亿磅，并且由于铁路相关事故增加而增加 3000 万美元的成本，由于卡车相关事故增加而增加 2000 万美元的成本。 轻载；航道深度损失 2 到 3 英尺会导致每年运输成本增加 490 万到 920 万美元 增加整个结构破裂的风险，这可能会阻碍航行并在高使用率的商业港口造成不安全的航行条件和船只延误 增加私人海洋结构、船坞、码头、船库、系泊船只、船坞和其他海洋结构受损的风险
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将打靶特定人源基因的 Cas9 和 sgRNA 转染到 HEK293 细胞。转染所用的质粒 DNA 上含有 表达带双端核定位序列 （ NLS ）的 Cas9 及 sgRNA 的表达框，通过 TransIT-X2 (Mirus) 转染 试剂进行转染。转染所用的 Cas9 mRNA 进行了假尿苷和 5- 甲基胞嘧啶修饰且带有双端 核定位序列，使用 transIT-mRNA 转染试剂将 sgRNA 和 mRNA 共转染。 Cas9 RNPs 使用脂质 体 RNAiMAX ( Life Technologies ) 进行反向转染， RNP 的终浓度为 10 nmol 。 Cas9 蛋白上不含 核定位序列。 EnGen Cas9 含有双端核定位序列。编辑效率通过 T7E1 实验进行分析，结果 以修饰百分比进行统计。