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World File Search System受精卵
利用国产基因组编辑技术对小鼠、大鼠受精卵进行大规模基因组编辑……
这项研究得到了日本学术振兴会 (JSPS) KAKENHI（资助编号：18H03974、19KK0401、22K19238、23H00367、24K02010、22H04922（AdAMS））、日本科学技术振兴机构 COI-NEXT（JPMJPF2010）和日本医疗研究发展机构 (AMED)（24bm12230009）的支持。 名词解释（注1） CRISPR-Cas3：许多细菌都有一种名为CRISPR-Cas系统的防御系统，类似于适应性免疫。 CRISPR-Cas3属于1类CRISPR系统，2019年被报道为一种使用多蛋白复合物人工切割DNA的国产基因组编辑工具。 （注2）脱靶突变：在基因组编辑技术中，DNA序列中非预期的突变发生在特定目标序列以外的位置。最大限度地减少脱靶突变被认为对于基因组编辑技术的高度安全性至关重要。 （注3）长读测序：与传统方法相比，一次分析更长片段的DNA或RNA碱基序列的技术。在本研究中，我们使用了纳米孔测序方法，这是一种通过将序列穿过纳米级孔（纳米孔）实现高速解码的技术。
简单的电穿孔即可在小鼠受精卵中实现高效的 CRISPR/Cas9 基因组编辑
受精卵电穿孔是小鼠中 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑中复杂的原核注射程序的快速替代方法。然而，目前的电穿孔方案要么需要投资专门的电穿孔仪，要么需要对受精卵进行腐蚀性预处理，这会损害胚胎的活力。在这里，我们描述了一种易于适应的方法，通过使用带有合成 CRISPR/Cas9 组件的普通电穿孔仪对完整的受精卵进行电穿孔，高效地在小鼠中引入特定突变，并且技术要求最低。该方案可有效处理来自各种遗传背景的受精卵，并与其他 CRISPR 核酸酶（如 Cas12a）兼容。
优化电穿孔参数，使用 3 至 2000 kDA 的荧光葡聚糖将大分子有效递送至猪受精卵中
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可证（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。
一种无需体外处理受精卵的大片段敲入动物生产的新技术
AAVpro 包装质粒 (AAV2，#6234；AAV5，#6664；AA6，#6665，Takara Bio) 和 AAVpro 293T 细胞系 (#632273，Takara Bio)。所有 AAV 载体质粒均通过将对应于目标基因座和敲入序列的 PCR 片段克隆到 EcoRV 和 BglII 限制位点之间的 pAAV-CMV 载体中，去除 CMV 启动子、b-珠蛋白内含子和 hGH polyA 来构建。按照制造商的说明，使用 Xfect 转染试剂 (#631318，Clontech) 将 AAV 质粒和包装质粒转染 293T 细胞。使用 AAVpro 纯化试剂盒 (所有血清型) (#6666，Takara Bio) 提取和浓缩 AAV。使用 AAVpro 滴定试剂盒（#6233，Takara Bio）和热循环仪 Dice 实时系统 III（TP950，Takara Bio）估算病毒基因组拷贝数。
水稻受精卵、成熟胚、未成熟胚再生植株突变的全基因组序列分析
通过全基因组测序，研究了由单个母株的合子、成熟胚和未成熟胚再生的水稻植株 (Oryza sativa L.，‘Nippon-bare’) 的体细胞克隆变异。还对母株和其种子繁殖子代进行了测序。在子代中检测到了 338 个母株序列变异，平均值范围从种子繁殖植株的 9.0 到成熟胚再生体的 37.4。利用种子繁殖植株中的变异计算出的自然突变率为 1.2 × 10 –8，与之前报道的值一致。种子繁殖植株中变异的单核苷酸变异 (SNV) 比例为 91.1%，高于之前报道的 56.1%，且与再生体中的差异不显著。总体而言，如前所述，再生体中 SNV 的转换与颠换比率较低。成熟胚再生的植物的变异明显多于不同子代类型。因此，在水稻遗传操作过程中，使用受精卵和未成熟胚可以减少体细胞克隆变异。
水稻受精卵、成熟胚、未成熟胚再生植株突变的全基因组序列分析
通过全基因组测序，研究了由单个母株的合子、成熟胚和未成熟胚再生的水稻植株 (Oryza sativa L.，‘Nippon-bare’) 的体细胞克隆变异。还对母株和种子繁殖子代进行了测序。在子代中检测到了 338 个母株序列变异，平均值范围从种子繁殖植株的 9.0 到成熟胚再生体的 37.4。利用种子繁殖植株中的变异计算出的自然突变率为 1.2 × 10 –8，与之前报道的值一致。种子繁殖植株中变异的单核苷酸变异 (SNV) 比例为 91.1%，高于之前报道的 56.1%，且与再生体中的差异不显著。总体而言，如前所述，再生体中 SNV 的转换与颠换比率较低。成熟胚再生的植物的变异明显多于不同子代类型。因此，在水稻遗传操作过程中，使用受精卵和未成熟胚可以减少体细胞克隆变异。
小鼠受精卵电穿孔 - NET
本文件中介绍的方法由一位在实验中使用过 Alt-R CRISPR-Cas9 系统的 IDT 客户提供。本文件可作为在类似模型生物中使用 Alt-R CRISPR-Cas9 系统的起点，但可能并未针对您的基因或应用进行完全优化。IDT 不保证方法或此类方法的任何性能。IDT 应用专家只能提供与本文件中概述的方法相关的一般技术支持和故障排除支持。
N-甲基-N-亚硝脲诱变受精卵细胞引起的水稻突变体文库成员的全基因组测序
摘要 尽管靶向基因组编辑技术已成为加速功能基因组学的有力反向遗传方法，但由化学诱变剂诱导的传统突变体文库对于植物研究仍然很有价值。含有化学诱导突变的植物是简单而有效的遗传工具，可以在不考虑生物安全问题的情况下种植。突变体个体的全基因组测序减少了突变体筛选所需的工作量，从而提高了它们的实用性。在本研究中，我们对由用 N-甲基-N-亚硝脲 (MNU) 处理单个受精卵细胞而获得的 Oryza sativa cv. Nipponbare 突变体文库成员进行了测序。通过对该突变体文库中的 266 株 M 1 植物进行全基因组测序，我们总共鉴定出 66 万个诱导点突变。这个结果代表了 373 Mb 组装水稻基因组中每 146 kb 基因组序列中有一个突变。这些点突变均匀分布于整个水稻基因组中，超过 70,000 个点突变位于编码序列内。尽管该突变体文库规模较小，但近 61% 的所有注释水稻基因中均发现了非同义突变，8.6%（3248 个基因）的点突变对基因功能有较大影响，例如获得终止密码子或丢失起始密码子。WGS 表明使用水稻受精卵细胞的 MNU 诱变可有效诱导突变，适用于构建用于计算机突变体筛选系统的突变体文库。扩展该突变体文库及其数据库将提供一种有用的计算机筛选工具，以促进功能基因组学研究，特别是针对水稻。关键词：水稻突变体文库、N-甲基-N-亚硝脲 (MNU)、单核苷酸变体 (SNV)、NGS、计算机 TILLING、水稻、全基因组测序、遗传资源
将受精卵注射到牛胚胎中，对自然发生的序列变异进行基因组编辑
基因组编辑通过有针对性地引入天然序列变体，加速遗传增益，为改进当前的牛育种策略提供了机会。这可以通过在修复模板存在的情况下利用编辑器诱导的基因组切割后的同源性定向修复机制来实现。将基因组编辑器引入受精卵并在胚胎中进行编辑的优势在于，活体动物的发育不会受到影响，并且与当代基于胚胎的改良实践保持一致。在我们的研究中，我们调查了引入已知的前黑素体蛋白 17 ( PMEL ) 和催乳素受体 ( PRLR ) 基因的序列变体，并产生完全转化为精确基因型的非嵌合体编辑胚胎的潜力。将 gRNA/Cas9 编辑器注射到牛受精卵中以将 3 bp 缺失变体引入 PMEL 基因，可产生高达 11% 的完全转化胚胎。使用 TALEN 后，转化率提高到 48%，但前提是通过质粒递送。在几种已知 PRLR 序列变体、不同修复模板设计和 DNA、RNA 或核糖核蛋白传递的背景下测试三种 gRNA/Cas9 编辑器，实现了高达 8% 的完全转化率。此外，我们还开发了一种基于活检的非嵌合体胚胎筛选策略，该策略有可能专门生产具有预期精确编辑的非嵌合体动物。
CRISPR/Cas9 介导的猪受精卵基因组编辑前的透明带处理
Abkowitz, JL、Persik, MT、Shelton, GH、Ott, RL、Kiklevich, JV、Catlin, SN 和 Guttorp, P. (1995)。大型动物造血干细胞的行为。美国国家科学院院刊，92 (6)，2031–2035。https://doi.org/10.1073/pnas.92.6.2031 Brinkman, EK、Kousholt, AN、Harmsen, T.、Leemans, C.、Chen, T.、Jonkers, J. 和 Van Steensel, B. (2018)。模板引导的 CRISPR/Cas9 编辑的简易量化。核酸研究，46 (10)，e58。 https://doi.org/10.1093/nar/gky164 Le, QA, Hirata, M., Nguyen, NT, Takebayashi, K., Wittayarat, M., Sato, Y., Namula, Z., Nii, M., Tanihara, F., & Otoi, T. (2020)。使用不同浓度的 Cas9 蛋白和靶向肌肉生长抑制素 (MSTN) 基因的 gRNA 进行电穿孔处理对猪受精卵发育和基因编辑的影响。动物科学杂志，91 (1)，e13386。 https://doi.org/10.1111/asj.13386 Li, R.、Liu, Y.、Pedersen, HS、Kragh, PM 和 Callesen, H. (2013)。猪单性生殖胚胎去除透明带后的发育和质量。Theriogenology，80 (1)，58–64。https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2013.03.009 Meurens, F., Summerfield, A., Nauwynck, H., Saif, L., & Gerdts, V. (2012)。猪：人类传染病的模型。微生物学趋势，20 (1)，50–57。Nishio, K., Tanihara, F., Nguyen, T.-V., Kunihara, T., Nii, M., Hirata, M., Takemoto, T., & Otoi, T. (2018)。电穿孔过程中电压强度对体外生产的猪胚胎发育和质量的影响。家畜繁殖，53 (2)，313–318。https://doi. org/10.1111/rda.13106 Peng, H., Wu, Y., & Zhang, Y. (2012)。通过电穿孔将 DNA 和吗啉代诺西酮有效递送到小鼠植入前胚胎中。PLoS One，7 (8)，e43748。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043748 Peura, TT, & Vajta, G. (2003)。绵羊和牛核移植中现有方法与新方法的比较。克隆干细胞，5 (4)，257–277。 https://doi.org/10.1089/153623003772032772 Qin, W., Dion, SL, Kutny, PM, Zhang, Y., Cheng, AW, Jillette, NL, Malhotra, A., Geurts, AM, Chen, Y.-G., & Wang, H. (2015). 通过合子电穿孔核酸酶在小鼠中实现高效的 CRISPR/Cas9 介导基因组编辑。遗传学，200 (2), 423–430。 https://doi.org/10.1534/ Genetics.115.176594 Remy, S., Chenouard, V., Tesson, L., Usal, C., Ménoret, S., Brusselle, L., Hes- lan, J.-M., Nguyen, TH, Bellien, J., Merot, J., De Cian, A., Giovannangeli, C., Concordet, J.-P., &Anegon, I. (2017). 通过使用电穿孔将 CRISPR/Cas9 蛋白和供体 DNA 递送到完整受精卵中来生成基因编辑大鼠。科学报告，7 (1)，16554。https://doi.org/10。 1038/s41598-017-16328-y Tanihara, F.、Hirata, M.、Nguyen, NT、Sawamoto, O.、Kikuchi, T.、Doi, M. 和 Otoi, T. (2020)。通过将 CRISPR/Cas9 系统电穿孔到体外受精的受精卵中有效生成 GGTA1 缺陷猪。BMC Biotechnology，20 (1)，40。https://doi.org/10.1186/s12896-020-00638-7