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CRISPR/Cas9 基因敲除及随后的野生型和突变型基因拯救的改进策略
将荧光标记 mOrange 插入到流行的 pLentiCrispr-V2 中，以创建包含嘌呤霉素选择和荧光标记的 pLentiCrispr-V2-mOrange (V2mO)，使病毒产生和靶标转导可见。用该质粒和适当的向导 RNA (gRNA) 包装的慢病毒成功敲除了人胃癌细胞系中的 RhoA、Gli1 和 Gal3 基因。Cas9-gRNA 编辑效率可以直接从 Cas9-gRNA 转导细胞中 gRNA 区域周围的短聚合酶链反应产物的 Sanger 电泳图来估计。必须对转导的靶细胞池进行单克隆以建立稳定的敲除克隆。仅当 gRNA 结合的 cDNA 被三个核苷酸修饰而氨基酸序列保持不变时，才能成功将野生型（RhoA 和 Gal3）和突变型（RhoA.Y42C）基因拯救到敲除细胞中。在 Gal3 基因中观察到严格的靶向 CRISPR/Cas9 编辑，但在 RhoA 基因中未观察到，因为 RhoA.Y42C 已经在 gRNA5 结合位点出现核苷酸变化。总之，我们改进的策略增加了这些优势：在流行的慢病毒系统中添加可视化标记、监测慢病毒的生产和转导效率、通过荧光激活细胞分选在靶细胞中分选 Cas9+ 细胞、通过 gRNA 结合位点周围的短 PCR 电泳图直接估计靶细胞池的基因编辑效率、以及在敲除细胞中成功拯救野生型和突变型基因，通过修饰 cDNA 克服 Cas9 编辑。
TORC1 过度激活导致 HER2 突变型癌症对泛 HER 酪氨酸激酶抑制剂 Neratinib 产生耐药性
Dhivya R. Sudhan，1 Angel Guerrero-Zotano，2 Helen Won，Paula Gonza´ Lez Ericsson，4 Alberto Servetto，1 Mariela Huerta-Rosario，1 Dan Ye，1 Kyung-Min Lee，1 Luigi formisano，1 Luigi formisano，2 Yan Guo，5 Qi liu kip liu koth tig n n n lies n.迈克尔·J·威克（Michael J.美国纽约州4乳腺癌计划，范德比尔特 - 伊格兰癌症中心，美国纳什维尔5综合癌症中心，新墨西哥大学，阿尔伯克基医学科学中心，美国纳什维尔，美国田纳西州纳什维尔7霍华德·休斯·休斯医学院，德克萨斯大学医学中心。