XiaoMi-AI文件搜索系统
World File Search System同源
通过 CRISPR/Cas9 介导的同源重组将人类 gdnf 敲入牛 β-酪蛋白基因座*
帕金森病 (PD) 是一种常见且使人衰弱的神经退行性疾病，其源于多巴胺能神经元的损失，并伴有进行性运动功能障碍。神经胶质细胞衍生的神经营养因子 (GDNF) 在治疗 PD 和其他神经病方面非常有前景。在本研究中，我们应用 CRISPR/Cas9 技术开发了一种基因靶向敲入系统，用于在牛 β-酪蛋白基因位点表达人类 gdnf 基因。构建了 CRISPR/Cas9 表达质粒和 pP40-GN 载体。使用组织外植体法培养和收集牛胎儿成纤维细胞。然后将 pP40-GN 和 CRISPR/Cas9 载体电转染到牛胎儿成纤维细胞中。使用 G418 筛选抗性克隆，同时通过 PCR 分析和 PCR 产物测序鉴定目标克隆。采用耳组织阻断法成功分离培养牛胎儿成纤维细胞，将pP40-GN靶载体和CRISPR/Cas9表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞，经7天G418筛选，共获得12个健康、分离良好的细胞克隆，其中5个发生基因打靶事件。本研究为利用基因打靶牛乳腺生物反应器生产人GDNF蛋白奠定了基础，为PD的靶向治疗提供了新的策略。
Cas12a 直系同源物和工程变体的高通量分析，以增强基因组编辑活性
摘要：CRISPR/Cas12a（以前称为 Cpf1）是一种 RNA 引导的 VA 类 CRISPR 系统内切酶，为基因组工程提供了一种有前途的工具。目前已鉴定出 10 多个 Cas12a 直系同源物，并用于人类细胞的基因编辑。然而，新兴 Cas12a 直系同源物之间的功能多样性仍未得到充分探索。本文，我们通过构建包含 40,000 多个引导 RNA 的基因组整合、自切割、配对 crRNA 靶标文库，报告了 16 个 Cas12a 直系同源物在人类细胞中的编辑活性的高通量比较分析。三种 Cas12a 候选物由于其结构紧凑且编辑效率与 AsCas12a 和 LbCas12a 相当而表现出良好的潜力，而 AsCas12a 和 LbCas12a 的特征已得到充分表征。我们通过结构引导的蛋白质工程生成了三种精氨酸替代变体 (3Rv)：BsCas12a-3Rv (K155R/N512R/K518R)、PrCas12a-3Rv (E162R/N519R/K525R) 和 Mb3Cas12a-3Rv (D180R/N581R/K587R)。与野生型 Cas12a 效应子相比，这三种 Cas12a 变体均表现出增强的编辑活性和扩大的靶向范围 (NTTV、NTCV 和 TRTV)。三种 Cas12a 变体之间的碱基偏好分析表明，PrCas12a-3Rv 在具有典型 PAM TTTV 和非典型 PAM TTCV 的靶位点上表现出最高活性，而 Mb3Cas12a-3Rv 表现出与其他变体不同的识别特征，在 PAM TATV 的 -3 位置和 PAM ATCV 的 -4 位置容纳更多的核苷酸 A。因此，扩展的 Cas12a 工具箱和对 Cas12a 活动的更好理解应该有助于它们在基因组工程中的应用。
通过 CRISPR 辅助 ssODN 介导的同源定向修复对绵羊进行 Otoferlin 基因编辑
OTOF 基因编码耳蜗内毛细胞中表达的耳蜗蛋白，其不同突变会诱发一种耳聋，而耳聋是人类无综合征隐性听觉神经病谱系障碍的主要原因。我们报告了使用与不同 Cas9 成分（mRNA 或蛋白质）相关的 CRISPR 系统，在单链寡脱氧核苷酸 (ssODN) 辅助下诱导同源定向修复 (HDR)，生成了第一个 OTOF 突变大型动物模型。使用不同浓度的两个靶向外显子 5 和 6 的 sgRNA 与 Cas9 mRNA 或蛋白质 (RNP) 结合，并与靶向外显子 5 中 HDR 的 ssODN 模板混合，该模板包含两个 STOP 序列。共出生 73 只羔羊，其中 13 只出现插入/缺失突变（17.8%），其中 8 只（61.5%）通过 HDR 发生敲入突变。较高浓度的 Cas9-RNP 能更有效地诱导靶向突变，但对胚胎存活率和妊娠率有负面影响。本研究首次报道了 OTOF 破坏绵羊的产生，这可能有助于更好地理解和开发与遗传疾病相关的人类耳聋的新疗法。这些结果支持使用 ssODN 辅助的 CRISPR/Cas 系统作为牲畜基因编辑的有效工具。
KSQ-4279：一种用于治疗具有同源重组缺陷癌症的第一类USP1抑制剂
•KSQ-4279是一种可逆的，具有ki = 1.2nm的USP1的变构抑制剂•ksq-4279绑定和未结合的USP1结构均已解决，揭示了诱导的拟合机构
文章抑制 SHROOM1 可通过促进同源定向修复来改善体内和体外基因整合
摘要：同源重组 (HR) 常用于实现靶向基因整合，因为与微同源介导的末端连接 (MMEJ) 或非同源末端连接 (NHEJ) 相比，它具有更高的精度和可操作性。由于它只在细胞分裂期间发生，因此似乎对动物细胞和胚胎中的基因整合效率较低。在这里，我们开发了全基因组高通量筛选和随后的配对 crRNA 文库筛选，以寻找抑制同源定向修复 (HDR) 的基因。我们发现，在报告系统中，敲低 SHROOM1 的 HDR 细胞比对照细胞富集多达 4.7 倍。无论供体类型如何，下调 SHROOM1 均可显著促进人类和小鼠细胞中成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关蛋白 9 核酸酶 (Cas9) 切割后的基因整合。通过在微注射过程中应用 SHROOM1 siRNA，小鼠胚胎的敲入效率也可以加倍。HEK293T 细胞中 SHROOM1 缺失引起的 HDR 效率增加可被 HDR 抑制剂 YU238259 抵消，但不能被 NHEJ 抑制剂抵消。这些结果表明 SHROOM1 是一个 HDR 抑制基因，SHROOM1 敲低策略可能适用于多种应用，包括基因编辑以生成用于研究基因功能和人类疾病的细胞系和动物模型。
AAV 衣壳和 Cas9 的免疫正交直系同源物可规避基因治疗引起的免疫反应
基于蛋白质的疗法可以激活适应性免疫系统，导致中和抗体的产生以及细胞毒性 T 细胞介导的治疗细胞清除。本文表明，连续使用 CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9) 和腺相关病毒 (AAV) 的免疫正交直系同源物可以避开适应性免疫反应，并能够通过重复给药实现有效的基因编辑。我们比较了 284 种 DNA 靶向和 84 种 RNA 靶向 CRISPR 效应物以及 167 种 AAV VP1 衣壳蛋白直系同源物与 I 类和 II 类主要组织相容性复合体蛋白的总序列相似性和预测结合强度。我们预测 79% 的 DNA 靶向 Cas 直系同源物不会产生交叉反应性免疫反应，我们在小鼠中对三种 Cas9 直系同源物进行了验证，但预计 AAV 血清型之间存在广泛的免疫交叉反应。我们还表明，在体内有效
UPGMA-堆肥元素组的II型CRISPR RNA引导的内核酸酶Cas9同源物
极端环境条件，例如温泉，深海水热通风孔和有机堆肥是独特的微生物多样性的储层，为释放具有理想特性的新酶提供了潜力。微生物群落对这些环境条件的适应解释了它们的高基因组和代谢灵活性，并且它们经常用适合许多应用的新型酶编码酶[1]。这项工作的目的是从堆肥元组中搜索CRISPR-Cas9 DNA核酸酶的同源物。此类同源物可能对开发系统来编辑这种人工生物植物的各种细菌的基因可能很有趣。这些酶必须是热耐剂，因为堆肥期间的温度升高到90摄氏度或更多。耐热酶也可以用于编辑从其他极端生物型中分离出的细菌的基因组。使用此类序列的另一个额外奖励可以是使用热稳定的体外DNA编辑系统。对II型CRISPR-CAS9 DNA核酸内切酶的发现的TR（热固态）同源物的一项有趣的基础研究可以是对这些酶的结构研究，用于随后生产基于从堆肥组中提取的氨基酸序列的生物技术具有重要意义的突变体。
ik-930，一种旁系同源物tead抑制剂有效地减弱了耐药的持久性细胞增殖
• The Hippo pathway kinase cascade negatively regulates the activity of transcription cofactor YAP/TAZ in a complex with DNA-bound transcription factor TEAD1-4 • Mutations in the Hippo pathway that result in activation of YAP/TAZ/TEADs are prevalent in multiple cancers ( Lin et al., Nature Genetics 2015; McGowan et al., Genes Cancer 2017 ) • YAP/TAZ/TEADs transcriptional activity can also be induced upon inhibition of oncogenic drivers, leading to the emergence of drug tolerant "persister" cells and disease relapse ( Kurppa et al., Cancer Cell 2020) • IK-930 is a TEAD1 selective palmitoylation inhibitor (see poster #1646) that effectively inhibits the transcriptional activity of YAP • IK-930 combined with EGFRI或MEKI可以防止持久细胞的出现并减轻对这些靶向疗法的抵抗力•IK-930目前处于第一阶段临床发展（NCT05228015）
同源修复模板 DNA 链间交联增强人类细胞中的基因编辑
CRISPR–Cas9 通过产生 DNA 双链断裂 (DSB) 并随后激活细胞 DNA 修复途径实现基因编辑。根据所参与的修复途径，结果可能包括目标基因的破坏或用恢复或引入功能的新序列替换 1 。后一种基因替换事件需要传递编码新序列的模板 DNA，其水平应支持基因替换，但不会对细胞活力产生不利影响。在转化应用中，模板分子通常由病毒载体递送。虽然有效，但病毒工作流程成本高昂、难以扩大规模且对细胞有潜在毒性。因此，使用非病毒模板 DNA 是一种有吸引力的替代方案，但非病毒模板的效率和急性毒性可能不如病毒递送 2 。改进的非病毒基因编辑将成为揭示 DNA 修复机制的有力方法、有用的实验室技术和治疗多种疾病的有前途的策略 3 。一种高效的非病毒基因编辑策略是传递核糖核蛋白（RNP）制剂，包括靶向核酸酶Cas9、单向导RNA（sgRNA）和模板分子，该模板分子包含与被编辑区域以及要修改或插入的序列的同源性4。这些RNP在基因组的目标区域引入DSB，然后通过易错末端连接（EJ）过程修复断裂末端，或通过同源性定向修复（HDR）过程修复DSB，该过程使用单独模板分子1中编码的序列解决DSB（扩展数据图1a）。使用HDR将新的DNA序列引入目标位置可以实现令人兴奋的功能获得应用5。因此，增加HDR频率的策略可能会改善结果并降低实验室和生物医学工作流程的成本。
靶向卵巢癌的同源重组缺乏症：parp抑制剂：影响整体生存的合成致命策略
简单的摘要：癌症治疗的合成致死性方法涉及将事件结合起来引起癌细胞死亡。使用这种策略，在治疗同源重组修复（HRR）途径缺陷的卵巢癌的女性方面已经取得了重大进展。由于HRR途径有缺陷，由于基因（例如BRCA1或BRCA2）的突变或表观遗传变化，细胞无法再精确地修复双链断裂（DSB）。利用这种弱点，对修复单链断裂（SSB）的聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）的药理抑制作用会导致HRR有缺陷的细胞中的合成致死性。PARP抑制剂（PARPIS），包括Olaparib，Niraparib和Rucaparib，被批准用于卵巢癌女性的临床管理。理解和克服对PARPIS的抵抗力的问题，扩展了这些策略，以使更多的患者受益，并将PARPI与其他药物（包括免疫疗法）相结合，在当今的领域中是很高的优先事项。