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化学修饰的 AsCas12a 向导 RNA 可改善不同组织中脂质纳米颗粒介导的体内基因编辑
（Cytiva）。LNP 货物是编码工程 AsCas12a 核酸酶和 gRNA 的 mRNA，重量比为 1:1。通过 RiboGreen 测定法（ThermoFisher Scientific）评估 LNP 的包封率大于 80%，多分散性指数 (PDI) <0.2，通过 Zetasizer 分析（Malvern Panalytical，型号 ZSU3205）评估平均直径大小 <105 nm。• 细胞培养处理：用指定浓度的包封 AsCas12a mRNA 的 LNP 处理细胞，并在转染后 72 小时分离 gDNA。原代人肝细胞 (PHH) 的转染包括重组人载脂蛋白 E。进行基于扩增子的下一代测序 (NGS) 以确定编辑百分比。 • 小鼠眼内体内编辑：通过前房内注射将 LNP 递送至每只 hMYOC Y437H（具有 Y437H 突变的人类肌动蛋白基因）敲入小鼠的一只眼中。注射后一周，解剖眼球，从前房分离 mRNA。采用基于转录本的 RT-ddPCR 检测来测量剩余 hMYOC mRNA 的程度。 • 小鼠肝脏内体内编辑：通过尾静脉静脉注射将 LNP 递送至 hMYOC Y437H 小鼠。注射后一周，解剖肝脏，分离 gDNA，并进行基于扩增子的 NGS 以确定编辑百分比。 • 体外结合亲和力测量：将标记的未修饰的向导与重组工程 AsCas12a 和浓度不断增加的修饰“测试”向导混合，在室温下孵育 3 小时，然后在硝酸纤维素印迹膜 (Cytiva) 和 Hybond N+ 膜 (Cytiva) 上进行双重过滤分离。在每个膜上定量荧光标记的未修饰向导，并计算结合的未修饰向导的百分比。标记的未修饰向导的结合百分比降低是由于来自修饰的“测试”向导的结合竞争。
RFD40 UHF RFID雪橇配件指南 VC8300产品参考指南 WT6400可穿戴计算机规格表 TC52产品参考指南 打印机配置文件管理器企业安装指南 ZD620T ZD420T电池电源基地（WW） 电池管理和安全实践移动设备... MC3400系列可持续性传单 电池管理和安全实践 RS5100/RS6100附件指南 Aurora设计助理 TC72/TC77产品参考指南 斑马DNA云3.10 WT6300 Android™产品参考指南 使用安全评估向导打印Android的DNA打印机设置实用程序 斑马DNA云4.0 MC9400/MC9450产品参考指南 材料安全数据表
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使用杜邦™ AmberChrom™ 层析树脂纯化单向导 RNA 寡核苷酸手册
由于寡核苷酸合成是一个连续过程，如果步骤效率低于 100%，则目标寡核苷酸的理论产量会随着序列长度的增加而降低。顺序固相寡核苷酸合成技术适用于长度最多约为 150 nt 的寡核苷酸，每一步都有可能因副反应和原材料杂质而引入失败序列。据估计，每个合成循环的效率约为 98.5-99%。3 如表 1 所示，即使步骤效率高达 99%，在 100 个循环后，总理论产量也只有 37%。由于失败序列可能对目标特异性有害，因此应在配制前通过纯化将其去除。序列杂质可能难以去除；但是，反相 HPLC (RP-HPLC) 等强大的纯化技术可用于各种序列和长度的寡核苷酸。
基于工程双组分向导 RNA 的分子接近传感器
合成生物学的目标之一是能够设计具有可编程输入和输出的任意分子电路。此类电路将电子电路和自然电路的特性结合起来，以可预测的方式在活细胞内处理信息。基因组编辑是合成分子电路的潜在强大组成部分，无论是用于调节目标基因的表达还是用于将信息稳定地记录到基因组 DNA 中。然而，将蛋白质-蛋白质相互作用或诱导接近等分子事件编程为基因组编辑的触发因素仍然具有挑战性。在这里，我们展示了一种称为“P3 编辑”的策略，它将蛋白质-蛋白质接近与功能性 CRISPR-Cas9 双组分向导 RNA 的形成联系起来。通过设计 crRNA：tracrRNA 相互作用，我们证明了各种已知的蛋白质-蛋白质相互作用以及化学诱导的蛋白质结构域二聚化可用于激活人类细胞中的原始编辑或碱基编辑。此外，我们还探索了 P3 编辑如何整合基于 ADAR 的 RNA 传感器的输出，从而可能允许特定 RNA 在更大的电路中诱导特定的基因组编辑。我们的策略增强了基于 CRISPR 的基因组编辑的可控性，有利于其在活细胞中部署的合成分子回路中的应用。
利用 mRNA 和合成向导 RNA 进行碱基编辑的精准平台
精确定位碱基编辑平台的开发目的是通过使用 RNA 适体 (Collantes, 2021) 来有效招募碱基修饰酶。精确定位碱基编辑系统可有效诱导靶标特异性核苷酸变化，而不会形成 DNA 双链断裂或插入缺失。该系统由三个部分组成：[1] 核酸酶缺陷型“切口酶” nCas9，仅切割或“切口”单链 DNA，与尿嘧啶糖基化酶 (UGI) 抑制剂融合 (Komor, 2016)，[2] 胞苷脱氨酶碱基编辑器 (大鼠 APOBEC) 与适体结合蛋白融合，以及 [3] 适体单向导 RNA (sgRNA)，可将 nCas9 和适体-脱氨酶融合物招募到特定的 DNA 靶位点（图 1）。将这三种成分递送到哺乳动物细胞中可诱导高度特定水平的 CG 到 TA 碱基转化，适用于涉及单个氨基酸点突变或功能性基因敲除的细胞和基因治疗应用。
通过改进的向导 RNA 文库克隆实现紧凑型 CRISPR 基因筛选
背景 20 多年前，人类基因组计划产生了第一个组装的人类基因组 [1,2]。基因组测序工作揭示了与疾病相关的基因和遗传变异，但大部分并未揭示基因功能。因此，功能基因组学工作对于确定已鉴定的约 20,000 个人类蛋白质编码基因的功能至关重要。在过去十年中，基于 CRISPR（成簇的规律间隔的短回文重复序列）的筛选增加了全基因组遗传筛选的便利性，使研究人员能够发现生物途径的新成分、确定现有药物的机制、确定新的治疗靶点并揭示协同遗传关系 [3-7]。然而，由于全基因组向导文库的规模（20,000–200,000 + 个元素）和典型的细胞覆盖率（500–1000 倍）需要准确量化基因命中并平均整个群体中与表型无关的变异，每次筛选需要每个样本数千万到数亿个细胞 [ 8 – 12 ]。这一要求对需要大规模培养的细胞模型提出了后勤挑战
基于纵向导弹系统的基于综合指导和控制
通常，使用各种方法（例如非线性控制和最佳控制）开发了导弹指导和控制系统。它们由指导和控制组成，并已单独开发。先前的研究是在指导循环与控制循环之间没有耦合的前提下进行的。在Ref [1]中，为导弹控制设计了三环结构，并通过线性二次调节器得出了控制增益。ref [2]使用后替式技术，并结合了状态重建和神经网络以增强鲁棒性。ref [3]使用非线性滑动模式控制（SMC）技术来避免聊天问题，并根据边界层厚度分析E ff ect。尽管先前研究的表现令人满意，但是设计和整合指导和控制是复杂而昂贵的。另外，由于快速的几何变化或系统的稳定性，控制器无法遵循加速命令。解决这些问题，是一种同时处理指导和控制的集成指导和控制方法（IGC）。参考。 [4，5]定义了导弹的动力学，并基于模型预测控制（MPC）进行了IGC研究。 参考。 [6]设计了SMC，以最大程度地减少零-E ff ort-ort-biss（ZEM），即已知目标的操纵加速度的前提。 参考。 [7]开发了IGC系统，该系统通过将SMC技术与强大的干扰观察者相结合，可以使干扰可靠。参考。[4，5]定义了导弹的动力学，并基于模型预测控制（MPC）进行了IGC研究。参考。 [6]设计了SMC，以最大程度地减少零-E ff ort-ort-biss（ZEM），即已知目标的操纵加速度的前提。 参考。 [7]开发了IGC系统，该系统通过将SMC技术与强大的干扰观察者相结合，可以使干扰可靠。参考。[6]设计了SMC，以最大程度地减少零-E ff ort-ort-biss（ZEM），即已知目标的操纵加速度的前提。参考。 [7]开发了IGC系统，该系统通过将SMC技术与强大的干扰观察者相结合，可以使干扰可靠。参考。[7]开发了IGC系统，该系统通过将SMC技术与强大的干扰观察者相结合，可以使干扰可靠。参考。 [8]考虑了观察目标状态的带状搜索者的视野。 参考。 [9]考虑了末端冲击角，以增强截距的E ff效果。 参考。 [10]进行了一项研究，以使用两个快速和缓慢的控制器来应对快速的几何变化。 尽管总体研究产生了令人满意的表现，但他们也没有考虑使用噪音损坏的观察。 为了减轻这个问题，深入的加强学习（DRL）正在吸引人们作为一种新方法。 DRL是增强学习的领域，它结合了深层的神经网络和增强学习算法，因此代理商与环境互动并以最大的奖励学习了政策。 这种方法在没有预定义的解决方案的情况下解决了解决问题的巨大潜力，并已用于导弹指导和控制系统。 Ref [11]进行了一项研究，以使用深层确定性策略梯度（DDPG）技术替换导弹态度控制器。 参考。 [12]试图使用2D运动学中的DDPG技术替换现有的指导技术。 但是，基于DRL的研究并未在IGC系统中积极进行。 在这项研究中，为了克服上述研究的局限性，我们提出了基于DRL的集成指导和控制法。 此方法通过将指导和控制纳入策略网络而进行。 为此，导弹参考。[8]考虑了观察目标状态的带状搜索者的视野。参考。 [9]考虑了末端冲击角，以增强截距的E ff效果。 参考。 [10]进行了一项研究，以使用两个快速和缓慢的控制器来应对快速的几何变化。 尽管总体研究产生了令人满意的表现，但他们也没有考虑使用噪音损坏的观察。 为了减轻这个问题，深入的加强学习（DRL）正在吸引人们作为一种新方法。 DRL是增强学习的领域，它结合了深层的神经网络和增强学习算法，因此代理商与环境互动并以最大的奖励学习了政策。 这种方法在没有预定义的解决方案的情况下解决了解决问题的巨大潜力，并已用于导弹指导和控制系统。 Ref [11]进行了一项研究，以使用深层确定性策略梯度（DDPG）技术替换导弹态度控制器。 参考。 [12]试图使用2D运动学中的DDPG技术替换现有的指导技术。 但是，基于DRL的研究并未在IGC系统中积极进行。 在这项研究中，为了克服上述研究的局限性，我们提出了基于DRL的集成指导和控制法。 此方法通过将指导和控制纳入策略网络而进行。 为此，导弹参考。[9]考虑了末端冲击角，以增强截距的E ff效果。参考。 [10]进行了一项研究，以使用两个快速和缓慢的控制器来应对快速的几何变化。 尽管总体研究产生了令人满意的表现，但他们也没有考虑使用噪音损坏的观察。 为了减轻这个问题，深入的加强学习（DRL）正在吸引人们作为一种新方法。 DRL是增强学习的领域，它结合了深层的神经网络和增强学习算法，因此代理商与环境互动并以最大的奖励学习了政策。 这种方法在没有预定义的解决方案的情况下解决了解决问题的巨大潜力，并已用于导弹指导和控制系统。 Ref [11]进行了一项研究，以使用深层确定性策略梯度（DDPG）技术替换导弹态度控制器。 参考。 [12]试图使用2D运动学中的DDPG技术替换现有的指导技术。 但是，基于DRL的研究并未在IGC系统中积极进行。 在这项研究中，为了克服上述研究的局限性，我们提出了基于DRL的集成指导和控制法。 此方法通过将指导和控制纳入策略网络而进行。 为此，导弹参考。[10]进行了一项研究，以使用两个快速和缓慢的控制器来应对快速的几何变化。尽管总体研究产生了令人满意的表现，但他们也没有考虑使用噪音损坏的观察。为了减轻这个问题，深入的加强学习（DRL）正在吸引人们作为一种新方法。DRL是增强学习的领域，它结合了深层的神经网络和增强学习算法，因此代理商与环境互动并以最大的奖励学习了政策。这种方法在没有预定义的解决方案的情况下解决了解决问题的巨大潜力，并已用于导弹指导和控制系统。Ref [11]进行了一项研究，以使用深层确定性策略梯度（DDPG）技术替换导弹态度控制器。参考。 [12]试图使用2D运动学中的DDPG技术替换现有的指导技术。 但是，基于DRL的研究并未在IGC系统中积极进行。 在这项研究中，为了克服上述研究的局限性，我们提出了基于DRL的集成指导和控制法。 此方法通过将指导和控制纳入策略网络而进行。 为此，导弹参考。[12]试图使用2D运动学中的DDPG技术替换现有的指导技术。但是，基于DRL的研究并未在IGC系统中积极进行。在这项研究中，为了克服上述研究的局限性，我们提出了基于DRL的集成指导和控制法。此方法通过将指导和控制纳入策略网络而进行。为此，导弹
使用 SpCas9 和多个向导 RNA 在拟南芥中进行靶向基因删除：四个比两个更好
© 作者 2023。开放存取 本文根据知识共享署名 4.0 国际许可进行授权，允许以任何媒体或格式使用、共享、改编、分发和复制，只要您给予原作者和来源适当的信任，提供知识共享许可的链接，并指明是否做了更改。 本文中的图片或其他第三方资料包含在文章的知识共享许可中，除非资料的致谢中另有说明。 如果资料未包含在文章的知识共享许可中，且您的预期用途不被法定规定允许或超出允许用途，则需要直接从版权所有者处获得许可。 要查看此许可证的副本，请访问 http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ 。知识共享公共领域贡献豁免（http://creativeco mmons.org/publicdomain/zero/1.0/）适用于本文中提供的数据，除非数据来源中另有说明。
PD9300 AGM收费向导
根据AGM电池制造商的说法，电池寿命降低的最大原因是维护不良，放电，收费和收费过高。客户有责任清洁和维护电池连接，并避免排放量低于50％的排放深度（DOD）。AGM充电器可通过大多数电池制造商提供；但是，只有在充电期内将电池停用时，它们才有效。（充电时未操作12伏配件和设备。）这对于RV生活是不切实际的，因为RV的转换器/充电器为12伏系统提供电源，并同时向电池充电。RV转换器/充电器的电流功能较高，电压较低，而电压则比“最佳” AGM电池充电器。
通过选择性修饰带有 2'-氟和锁定核酸的向导 RNA 来提高 CRISPR/Cas9 系统的稳定性和特异性
摘要：利用 CRISPR/Cas 系统组件的基因组编辑方法已广泛应用于分子生物学、基础医学和基因工程。一种有前途的方法是通过修改基于 CRISPR/Cas 的基因组编辑系统的组件来提高其效率和特异性。在这里，我们设计并化学合成了含有修饰核苷酸（2'-O-甲基、2'-氟、LNA — 锁定核酸）或在某些位置含有脱氧核糖核苷酸的向导 RNA（crRNA、tracrRNA 和 sgRNA）。我们比较了它们对核酸酶消化的抵抗力，并检查了由这些修饰向导 RNA 引导的 CRISPR/Cas9 系统的 DNA 切割效率。用 2'-氟修饰或 LNA 核苷酸替换核糖核苷酸增加了 crRNA 的寿命，而其他类型的修饰不会改变它们的核酸酶抗性。 crRNA 或 tracrRNA 的修饰可保持 CRISPR/Cas9 系统的有效性。否则，具有修饰 sgRNA 的 CRISPR/Cas9 系统会显著降低 DNA 切割有效性。2'-氟修饰 crRNA 的系统 DNA 切割动力学常数较高。crRNA 的 2'-修饰还可降低体外 dsDNA 切割的脱靶效应。