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在 Komagataella phaffii 中通过宿主知情表达 CRISPR 引导 RNA 进行基因组工程
人们对使用非模式微生物作为生物制药制造宿主的兴趣日益浓厚。这些宿主需要进行基因组工程以满足临床相关的产品质量和滴度，但对于特征不明显的宿主，CRISPR-Cas9 等基因组编辑工具的适应性发展一直很缓慢。具体而言，缺乏对 RNA 聚合酶 III 转录的生化表征阻碍了向导 RNA 在新宿主中的可靠表达。在这里，我们提出了一种基于测序的策略，用于设计宿主特异性盒式磁带，以实现向导 RNA 的模块化、可靠表达。使用这种策略，我们在甲基营养酵母 Komagataella phaffii 中实现了高达 95% 的基因编辑效率。我们将这种方法应用于复杂表型的快速、多重工程，通过两个连续的工程步骤实现人源化产品糖基化。将简单的基因编辑工具可靠地扩展到非模型制造宿主，将能够快速设计针对特定产品配置的制造菌株，并可能降低工艺开发的成本和时间。
SNP-CRISPR：用于 SNP 特异性基因组编辑的网络工具
摘要 CRISPR-Cas9 是一种强大的基因组编辑技术，其中单个向导 RNA (sgRNA) 赋予靶位点特异性以实现 Cas9 介导的基因组编辑。已经基于人类和模型生物的参考基因组开发了大量 sgRNA 设计工具。然而，现有资源并不是最佳的，因为靶向区域内的基因突变或单核苷酸多态性 (SNP) 会干扰向导-靶互补性，从而影响基于 CRISPR 的方法的效率。为了便于识别 (1) 非参考基因组中的 sgRNA、(2) 不同遗传背景下的 sgRNA 或 (3) 针对含 SNP 的等位基因的特定靶向，例如疾病相关突变，我们开发了一个网络工具 SNP-CRISPR ( https://www.fl yrnai.org/tools/snp_crispr/ )。 SNP-CRISPR 可用于根据公共变异数据集或用户识别的变异设计 sgRNA。此外，该工具还计算针对变异和参考的 sgRNA 设计的效率和特异性得分。此外，SNP-CRISPR 提供了上传多个 SNP 的选项，并使用单个 sgRNA 设计同时针对一个或多个附近的碱基变化。鉴于这些功能，SNP-CRISPR 在模型系统中以及用于疾病相关变异校正的 sgRNA 设计中具有广泛的潜在研究应用。
引导 RNA 结构设计使组合 CRISPRa 程序能够进行生物合成分析
改造细菌代谢以有效地从多步骤途径产生化学物质和材料需要优化多基因表达程序以实现酶平衡。CRISPR-Cas 转录控制系统正在成为编程多基因表达调控的重要代谢工程工具。然而，向导 RNA 折叠的可预测性较差会通过不可靠的表达控制破坏酶平衡。我们设计了一组可以描述向导 RNA 折叠的计算参数，我们预计它们可以广泛适用于 CRISPR-Cas9 系统。在这里，我们将修饰的向导 RNA (scRNA) 对大肠杆菌中 CRISPR 激活 (CRISPRa) 的功效与描述折叠成活性结构的速率的动力学参数相关联。此参数还支持正向设计新的 scRNA，在我们的筛选中没有观察到失败。我们使用来自该组的 CRISPRa 靶序列来设计一个由三个合成启动子组成的系统，该系统可以在 >35 倍的动态范围内正交激活和调整所选输出的表达。独立的激活调节允许通过 64 个成员的组合三重 scRNA 库对三维表达设计空间进行实验探索。我们将这些 CRISPRa 程序应用于两种生物合成途径，证明了大肠杆菌中有价值的蝶啶和人乳寡糖产品的生产。对这些设计空间进行分析表明，表达组合产生的滴度比最大表达产生的滴度高出 2.3 倍。映射生产还可以确定瓶颈作为途径重新设计的目标，将寡糖乳糖-N-四糖的滴度提高 6 倍。在计算 scRNA 功效预测的帮助下，组合 CRISPRa 策略能够有效优化多步骤代谢途径。更广泛地说，这里揭示的引导 RNA 设计规则可能使有效的多引导程序的常规设计成为可能，用于细菌宿主中 CRISPR 基因调控的广泛模型和数据驱动应用。
什么是 CRISPR？
这个想法源自细菌中发现的一种简单防御系统。为了保护自己免受病毒侵害，细菌会捕获入侵病毒的 DNA 片段，并将其存储为称为 CRISPR 的片段。如果同一种病毒试图再次攻击，细菌会将 CRISPR DNA 转化为向导 RNA，并将其附着到切割酶 (Cas9) 上，该酶可用于切割入侵病毒的 DNA。
学生发现心脏的工作原理
七台计算机的脑精神完全迎接了Bebras挑战！由Raspberry Pi Foundation和Oxford University带给您的年度挑战，测试了年轻的计算机天才，使他们对计算机科学和计算思维的味道都有。我们为这些未来的计算向导感到自豪！，乐趣不止于此 - 所有学生都被邀请参加ACE的下一个水平挑战。愿我们的学生出去征服！
OTS - 基因编辑专利.docx
Prime 编辑通过使用向导 RNA 将 Prime 编辑复合物引导至 DNA 内的特定位置来实现这一点。该复合物含有一种经过修饰的 Cas9 蛋白，称为“Prime 编辑器”，与逆转录酶融合 (2)。Prime 编辑器旨在识别特定的 DNA 序列并切割双螺旋的一条链，从而使逆转录酶能够使用未切割的链作为模板，在切割位点添加或删除特定核苷酸。