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World File Search System嘌呤霉素
Invitrogen™ LentiArray™ 人类 CRISPR 文库，96 孔...
转导条件 • 您必须根据经验确定每种细胞系的转导条件和感染复数 (MOI)。如果需要共感染，我们建议对 Cas9 至 CRISPR 文库慢病毒颗粒使用 5–10 的 MOI 比率，以达到最佳基因敲除程度。 • 感染期间使用含较低水平 FBS（例如 3– 5% FBS）的培养基可能会增加某些细胞类型的转导效率。 • Polybrene™（六甲溴铵）可以将慢病毒转导到人细胞的效率提高 2–10 倍。您必须根据经验确定目标细胞的最佳 Polybrene™ 浓度（例如最大感染性，最小毒性）。我们建议使用浓度范围（2–8 µg/mL）对 Polybrene™ 耐受性进行初步测试。 • 如果您计划使用嘌呤霉素进行选择，则必须首先确定选择转导细胞所需的最佳嘌呤霉素浓度。抗生素批次、细胞类型、细胞生长动力学和细胞培养条件（包括细胞密度）会影响筛选所需的嘌呤霉素量。使用嘌呤霉素进行筛选通常需要 7-10 天。
p120 HDR 质粒 (h): sc-400943-HDR
含有由 CRISPR/Cas9 系统产生的双链断裂 (DSB) 的 DNA 可以通过非同源末端连接 (NHEJ) 或同源定向修复 (HDR) 途径进行修复 (1,2,3)。NHEJ 修复途径在切割位点引入非特异性插入或缺失，而 HDR 途径允许在 DSB 位点进行精确的基因编辑 (1,2,3)。靶向特异性 HDR 质粒为 DSB 提供 DNA 修复模板，当与 CRISPR/Cas9 KO 质粒共转染时，能够在发生 Cas9 诱导的 DNA 切割的位置插入特定的选择标记 (1,2)。HDR 质粒可以整合红色荧光蛋白 (RFP) 基因以直观地确认转染，并整合抗生素抗性基因 (嘌呤霉素) 以选择含有成功 CRISPR/Cas9 双链断裂的细胞。嘌呤霉素抗性和 RFP 编码基因两侧是两个 LoxP 位点，这些位点可被 Cre 载体识别，之后可利用该位点从基因组 DNA 中去除这些选择标记 (4,5)。
ßA1-晶体蛋白 HDR 质粒 (m): sc-419822-HDR
含有由 CRISPR/Cas9 系统产生的双链断裂 (DSB) 的 DNA 可以通过非同源末端连接 (NHEJ) 或同源定向修复 (HDR) 途径进行修复 (1,2,3)。NHEJ 修复途径在切割位点引入非特异性插入或缺失，而 HDR 途径允许在 DSB 位点进行精确的基因编辑 (1,2,3)。靶向特异性 HDR 质粒为 DSB 提供 DNA 修复模板，当与 CRISPR/Cas9 KO 质粒共转染时，能够在发生 Cas9 诱导的 DNA 切割的位置插入特定的选择标记 (1,2)。HDR 质粒可以整合红色荧光蛋白 (RFP) 基因以直观地确认转染，并整合抗生素抗性基因 (嘌呤霉素) 以选择含有成功 CRISPR/Cas9 双链断裂的细胞。嘌呤霉素抗性和 RFP 编码基因两侧是两个 LoxP 位点，这些位点可被 Cre 载体识别，之后可利用该位点从基因组 DNA 中去除这些选择标记 (4,5)。
一种快速对基因进行 GFP 标记并富集编辑细胞的方法
图 1. 供体 DNA 模板设计。TrueTag 供体 DNA 试剂盒提供用于 (A) N 端标记或 (B) C 端标记目标基因的 PCR 模板。具有短同源臂 (HA) 序列的位点特异性引物用于 PCR 扩增以生成供体 DNA 分子。通过 CRISPR-Cas9 或 TALEN ™ 系统切割目标位点后，供体 DNA 在 HDR 过程中整合到基因组中。2A 自切割肽 (2A) 允许选择标记 (嘌呤霉素或杀稻瘟素) 和标记基因从内源启动子表达。每个模板的通用引发序列 (Uni) 允许轻松设计 PCR 引物。
艾滋病新疗法
艾滋病是一种每年导致一百多万人死亡的传染病。最近，Dash 等人首次使用 CRISPR-Cas9 结合 LASER ART 在 HIV 感染的人源化小鼠中实现了功能性治愈，成功率达到三分之一。在这里，我使用理论方法设计了一种适用于人类的治疗策略，与 Dash 等人的治疗策略不同。这里介绍的实验性治疗包括注射 Env 定向整合酶缺陷型 CRISPR 基因编辑慢病毒载体（能够表达五重 gRNA）以及人源化 SpCas9 和由 T2A 连接的嘌呤霉素抗性基因，然后进行血浆/白细胞分离术和注射免疫抑制混合物，然后进行体内正向选择。我的方案如果通过临床试验得到证实，可能会对艾滋病毒感染者产生重大影响，并且有可能成为治疗艾滋病的参考方案，尽管目前它还处于假设和理论阶段。
量化锂离子电池中膨胀的方法：审查
图2杀死CHO-K1细胞的摇瓶中的曲线，抗生素尿霉素的浓度不同。实验总共进行了四个重复。每隔第二天（用黑色箭头表示）通过离心和在新鲜培养基中与补充纯嘌呤霉素重悬于细胞分离中。（a）描绘的是由Kuhner Tom设备确定的氧转移速率（OTR）。为了清楚起见，随着时间的推移，每个第十二个测量点都被标记为符号。在从数据中删除了由于温度适应引起的每个介质交换后，OTR数据中的单个Outliner。有关原始数据，请参阅图S2A。两个在线监视的生物学重复用实线和填充符号或虚线和开放符号表示。（b）离线培养了另外两种生物学重复。离线分析的生物学重复被描述为固体和填充的符号或虚线和开放符号。通过离线摇瓶通过Neubauer室法在每个培养基交换处确定可行的细胞密度（VCD）。（c）可行性是从相同样品中计算出来的。在Kuhner Tom设备中进行培养。培养条件：100 ml玻璃瓶，温度（T）= 36.5 C，摇动频率（n）= 140 rpm，摇动直径（D 0）= 50 mm，填充体积（V L）= 20 ml，5％CO 2，70％rel。哼。启动细胞密度：5 10 5细胞/mL。
CRISPR/Cas9 基因敲除及随后的野生型和突变型基因拯救的改进策略
将荧光标记 mOrange 插入到流行的 pLentiCrispr-V2 中，以创建包含嘌呤霉素选择和荧光标记的 pLentiCrispr-V2-mOrange (V2mO)，使病毒产生和靶标转导可见。用该质粒和适当的向导 RNA (gRNA) 包装的慢病毒成功敲除了人胃癌细胞系中的 RhoA、Gli1 和 Gal3 基因。Cas9-gRNA 编辑效率可以直接从 Cas9-gRNA 转导细胞中 gRNA 区域周围的短聚合酶链反应产物的 Sanger 电泳图来估计。必须对转导的靶细胞池进行单克隆以建立稳定的敲除克隆。仅当 gRNA 结合的 cDNA 被三个核苷酸修饰而氨基酸序列保持不变时，才能成功将野生型（RhoA 和 Gal3）和突变型（RhoA.Y42C）基因拯救到敲除细胞中。在 Gal3 基因中观察到严格的靶向 CRISPR/Cas9 编辑，但在 RhoA 基因中未观察到，因为 RhoA.Y42C 已经在 gRNA5 结合位点出现核苷酸变化。总之，我们改进的策略增加了这些优势：在流行的慢病毒系统中添加可视化标记、监测慢病毒的生产和转导效率、通过荧光激活细胞分选在靶细胞中分选 Cas9+ 细胞、通过 gRNA 结合位点周围的短 PCR 电泳图直接估计靶细胞池的基因编辑效率、以及在敲除细胞中成功拯救野生型和突变型基因，通过修饰 cDNA 克服 Cas9 编辑。
用于人类基因组的强大且多功能的阵列文库...
图 1. APPEAL 克隆。A、从载体 pYJA5 中去除氨苄青霉素抗性基因 (AmpR)。sgRNA1-4 和甲氧苄啶抗性基因 (TmpR) 与三个不同的 PCR 扩增子融合。所有元件均经过 Gibson 组装以形成 4sgRNA-pYJA5 质粒，并用甲氧苄啶筛选转化子。描绘了 4sgRNA-pYJA5 全质粒和 4sgRNA 盒的详细结构。LTR，长末端重复；Ψ，包装信号序列；PB，piggyBac 转座子元件；PuroR，嘌呤霉素抗性元件；hU6、mU6、hH1 和 h7SK 是普遍表达的 RNA 聚合酶 III 启动子；sg，sgRNA。 B、转化大肠杆菌并进行甲氧苄啶筛选后，代表性 pYJA5 限制性片段、3 片段 PCR 和 APPEAL 克隆产物的单菌落 PCR。Bbs I 消化 pYJA5 产生约 1 千碱基 (kb) 的 AmpR 元件条带和约 7.6 kb 的线性化载体条带（左）。使用相应的 sgRNA 引物进行 PCR 后，三个扩增子在琼脂糖凝胶上分别显示预期的 761、360 和 422 bp 大小（中）。使用转化细菌平板中 APPEAL 克隆产物 4sgRNA 盒两侧的引物进行单菌落 PCR 始终产生预期大小（2.2 kb，右）。 C ，8 个具有不同 4sgRNA 序列的独立 APPEAL 实验中正确、重组和突变 4sgRNA 质粒的百分比（每个实验测试 ≥22 个菌落）。D ，四个 APPEAL 实验中正确、重组和突变 4sgRNA 质粒的百分比。每个点代表一个由八个菌落组成的独立生物复制品（n=24；平均值 ± SEM）。E ，高通量格式的 APPEAL 克隆时间线（h：小时；d：天）。
研究论文 kin17 缺乏通过调节 Caspase 3、PARP 和 Bcl-2 家族蛋白促进宫颈癌细胞凋亡
背景 .由于晚期宫颈癌的治疗手段不具特异性以及缺乏分子靶向药物，晚期宫颈癌的治疗仍具有较大的挑战性，寻找新的宫颈癌治疗生物标志物十分必要。方法 .本研究通过转染携带KIN17 siRNA的重组慢病毒载体，构建kin17敲低的宫颈细胞株HeLa和SiHa，并用嘌呤霉素进行筛选。通过荧光观察和蛋白质印迹法检测建立的kin17敲低细胞。流式细胞术检测细胞凋亡和线粒体膜电位（MMP）。分光光度法检测caspase 3酶活性。蛋白质印迹法分析凋亡相关蛋白的表达谱。最后，我们利用生物信息学和蛋白质组学数据分析宫颈癌中的KIN相关基因。结果 .结果显示，转染基因沉默载体的HeLa和SiHa细胞中kin17的荧光阳性率较高（> 90%），基因沉默效率较高（> 65%）。此外，kin17的缺失分别使HeLa和SiHa细胞的MMP降低和凋亡率增加。此外，敲低kin17可以增强HeLa和SiHa细胞中caspase 3酶活性，增加裂解PARP和Bim的表达，同时降低Bcl-xL和磷酸化BAD的表达。宫颈癌KIN相关预后基因的鉴定显示，共构建了5个基因（FZR1、IMPDH1、GPKOW、XPA和DDX39A）用于该风险评分，结果显示CTLA4表达与风险评分呈负相关。结论。我们的研究结果表明，kin17 敲低可通过靶向 caspase 3、PARP 和 Bcl-2 家族蛋白促进宫颈癌细胞凋亡。此外，kin17 可以通过线粒体途径调控癌细胞凋亡，可作为调节宫颈癌细胞凋亡的新型治疗靶点。
利用 CRISPR/Cas9 介导的靶向整合生成 Y 染色体中含有 EGFP 基因的转基因克隆水牛胚胎
性别控制技术在家畜生产中具有重要意义，尤其对于快速繁殖的水牛（bubalus bubalis）具有重要意义，本研究以水牛为研究模型。我们已证实整合到小鼠Y染色体上的荧光蛋白可用于小鼠植入前胚胎的性别鉴定。首先，我们优化了增强型绿色荧光蛋白（eGFP）和mCherry外源基因在Neuro-2a细胞、小鼠胚胎干细胞、小鼠胚胎细胞（NIH3T3）、水牛胎儿成纤维细胞（BFF）中的靶向整合效率。结果表明，靶标两侧同源臂长度为800 bp比300 bp或300 bp/800 bp更有效。当细胞补充了 pifithrin-µ（一种抑制 p53 与线粒体结合的小分子）时，BFF 细胞中同源定向修复 (HDR) 介导的敲入也得到了显著改善。250 V 的三个脉冲在 BFF 细胞中产生最有效的电穿孔，并且发现 1.5 µ g/mL 嘌呤霉素是筛选的最佳浓度。此外，利用 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑结合体细胞核移植 (SCNT) 技术成功生成了 Y-Chr-eGFP 转基因 BFF 细胞和克隆水牛胚胎。在第 6-8 代时，Y-Chr-eGFP 转基因 BFF 细胞的生长率和细胞增殖率明显低于非转基因 BFF 细胞；甲基化相关基因 DNMT1 和 DNMT3a 的表达水平相似；然而，与非转基因细胞相比，Y-Chr-eGFP 转基因 BFF 细胞中乙酰化相关基因 HDAC1 、 HDAC2 和 HDAC3 的表达水平显著较高（p < 0.05）。Y-Chr-eGFP 转基因 BFF 被用作 SCNT 的供体，结果表明 eGFP 报告基因适用于胚胎性别的可视化。克隆水牛胚胎的囊胚率相似；然而，与对照相比，转基因克隆胚胎的卵裂率明显较低。总之，我们优化了产生转基因 BFF 细胞的方案，并使用这些细胞作为供体成功产生了 Y-Chr-eGFP 转基因胚胎。