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2014 年 12 月 1 日《洞穴与喀斯特研究杂志》第 76 卷第 3 期
摘要：一种地球物理方法的复合物用于研究旨在生产详细地质映射的小型喀斯特区域，以确认已知污水坑的地质定位，并发现表面以下洞穴和空隙的可能持续。应用偶极子电磁谱分析和辐射图（伽马射线光谱法）来确定硬碳酸盐岩石和风化的山谷填充沉积物的空间分布。在研究区域的选定位点进行了详细的高清磁力测定法，目的是区分污垢和人造的石灰kilns，即将石灰石加热并转化为石灰的坑。使用微重力和电抗性断层扫描（ERT）方法来创建地下洞穴的高分辨率图像。ERT和地质调查的结果用作重力建模的初始模型。各种尺寸的地下腔是对比的地球物理对象，根据填充材料的组成，电阻率的范围从非常电导的到相对电阻。电阻率属性的解释并不总是直接的。我们必须区分充气（高抗性）和壤土充满水的（低抗性）腔和断裂。合并的地球物理学方法使我们能够确定更准确的近表面地质模型，在我们的情况下，对ERT倒置中强导的强导异常的平行解释，重力建模的主要密度降低会导致在表面低于50至60 m的深度处的腔内存在。
严重事故报告 00/2518 - CAA
AFIS 模拟飞行仪表系统（新西兰航空公司用来区分‘传统’和‘玻璃’驾驶舱的通用术语） AFDS 自动驾驶仪飞行指引系统 AGL 地平面以上 A/P 自动驾驶仪 APP 自动飞行系统进近模式 AQD 航空质量数据库 ARINC 航空无线电公司 ASA 自动着陆状态信号器 A/T 自动油门 ATC 空中交通管制 CAANZ 新西兰民航局 Capt 机长 类别 CRM 机组资源管理 CDU 控制显示单元 CFIT 可控飞行撞地 CSB 载波加边带 CVR 驾驶舱语音记录器 DDM 调制深度差 DME 测距设备 EADI 电子姿态指示器 EFI 电子飞行仪表 EFIS 电子飞行仪表系统 EGPWS 增强型近地警告系统 EHSI 电子水平状况指示器 ETA 预计到达时间 ETD 预计离场时间 FA Faleolo VOR FAF 最后进近定位点 FAP 最后进近点FCC 飞行控制计算机 FCTM 飞行机组训练手册 FD 飞行指引器 FDR 飞行数据记录器 FMC 飞行管理计算机 FMCS 飞行管理计算机系统 F/O 副驾驶 FOQA 飞行运行质量保证 GPWS 近地警告系统 GP 下滑道（通常参考地面发射器时使用） G/S 下滑道（通常参考飞机仪表、接收器或机组程序时使用）
在 ES 细胞中进行 CRISPR 增强靶向后，靶向率和串联风险增加
摘要：法国小鼠诊所 (Institut Clinique de la Souris; ICS) 已生产出 2000 多个用于 C57BL/6N 小鼠“点菜”诱变的靶向载体。尽管大多数载体已成功用于小鼠胚胎干细胞 (ESC) 中的同源重组，但少数载体在多次尝试后仍无法靶向特定位点。我们在此表明，将 CRISPR 质粒与与之前失败的质粒相同的靶向构建体进行共电穿孔可以系统地获得阳性克隆。然而，必须仔细验证这些克隆，因为大量克隆（但不是全部）显示靶向质粒在位点处发生串联。详细的南方印迹分析可以表征这些事件的性质，因为标准的长距离 5′ 和 3′ PCR 无法区分正确和错误的等位基因。我们表明，在 ESC 扩增之前进行简单且廉价的 PCR 可以检测和消除带有串联体的克隆。最后，尽管我们只测试了小鼠 ESC，但我们的结果强调了任何结合使用 CRISPR/Cas9 和环状双链供体的转基因细胞系（如已建立的细胞系、诱导性多能干细胞或用于体外基因治疗的细胞系）存在错误验证的风险。我们强烈建议 CRISPR 社区在使用 CRISPR 增强任何细胞类型（包括受精卵母细胞）中的同源重组时，使用内部探针进行南方印迹。
康斯坦斯改变了拟南芥的昼夜节律
植物是无柄生物，已经获得了高度塑料发育策略以适应环境。在这些过程中，口腔过渡对于确保生殖成功至关重要，并且受到多个内部和外部遗传网络的最终调节。控制植物对白天长度的响应的光周期途径是控制流动的最重要的途径之一。在ara-bidopsis光周期旋转中，constans（CO）是中心基因，它在漫长的一天结束时在叶片中激活了叶片开花基因座t（ft）的表达。昼夜节律强烈地表达了CO的表达。迄今为止，尚无关于从光周期途径回到昼夜节律的反馈回路的证据。使用转录网络，我们确定了相关的网络图案，可以调节昼夜节律之间的相互作用。基因表达，染色质免疫沉淀实验和表型分析使我们能够阐明CO在昼夜节律中的作用。植物具有改变的CO表达的植物显示出不同的内部时钟周期，通过每日叶子节奏运动来衡量。我们表明，通过与启动子上的特定位点结合，CO上调了与昼夜节律时钟相关的关键基因的表达，例如CCA1，LHY，PRR5和GI。CO上的大量PRR5抑制靶基因上调，这可以解释COCo-Prr5复合物与BZIP转录因子HY5相互作用，并有助于将复合物定位在时钟基因的启动子中。总而言之，我们的结果表明，可能有一个反馈循环，可以在其中将循环回到昼夜节律时钟，从而为昼夜节律提供了季节性信息。
简化的CRISPR工作流程引入突变并产生用于建模肌萎缩性横向硬化症ERIC DENEAULT 1，MATHILD
1 1，麦吉尔大学，麦吉尔大学，麦克吉尔大学，蒙特利尔，QC加拿大QC H3A 2B4 *通讯作者：thomas.durcan@mcgill.ca摘要肌营养性侧面硬化症（ALS）代表着一种复杂的神经变性疾病，具有重要的属性症状。 迄今为止，遗传病因和驱动该疾病的潜在分子机制均尚未了解，尽管近年来，许多研究突出了许多ALS的遗传突变。 这些突变指出了可能在ALS中可能影响的潜在途径，具有产生人类神经元的能力和包含这些突变的其他疾病相关细胞的能力，如果出现新疗法，则变得更加关键。 随着诱导多能干细胞（IPSC）的出现，并定期间隔短的短文重复序列（CRISPR）基因编辑场为我们提供了在IPSC基因组中引入或纠正特定位点的特定突变的工具，从而模拟了风险突变的特定贡献。 在这项研究中，我们描述了一种将突变引入控制线或纠正突变的快速有效方法，从具有给定突变的患者衍生的IPSC产生了ISEGENIC控制线。 引入的突变是将G93A突变分成SOD1或H517Q中的FUS，而校正的突变是SOD1中I114T的患者IPSC线。 通过IPSCS和CRISPR编辑的组合，此处生成的细胞将提供对ALS中神经元变性的分子机制的基本见解。1，麦吉尔大学，麦吉尔大学，麦克吉尔大学，蒙特利尔，QC加拿大QC H3A 2B4 *通讯作者：thomas.durcan@mcgill.ca摘要肌营养性侧面硬化症（ALS）代表着一种复杂的神经变性疾病，具有重要的属性症状。迄今为止，遗传病因和驱动该疾病的潜在分子机制均尚未了解，尽管近年来，许多研究突出了许多ALS的遗传突变。这些突变指出了可能在ALS中可能影响的潜在途径，具有产生人类神经元的能力和包含这些突变的其他疾病相关细胞的能力，如果出现新疗法，则变得更加关键。随着诱导多能干细胞（IPSC）的出现，并定期间隔短的短文重复序列（CRISPR）基因编辑场为我们提供了在IPSC基因组中引入或纠正特定位点的特定突变的工具，从而模拟了风险突变的特定贡献。在这项研究中，我们描述了一种将突变引入控制线或纠正突变的快速有效方法，从具有给定突变的患者衍生的IPSC产生了ISEGENIC控制线。引入的突变是将G93A突变分成SOD1或H517Q中的FUS，而校正的突变是SOD1中I114T的患者IPSC线。通过IPSCS和CRISPR编辑的组合，此处生成的细胞将提供对ALS中神经元变性的分子机制的基本见解。小分子和生长因子的组合被用来指导编辑的细胞逐步分化为运动神经元，以证明可以为下游应用生成相关的疾病细胞。关键字：CRISPR，ISEGONIC IPSC，ALS，SOD1 -I114T，SOD1 -G93A，FUS -H517Q
基因工程工具 CRISPR/CAS 概述
摘要 本文献研究的目的是描绘出 CRISPR/Cas 在基因工程中的应用方式、使用该方法所带来的机遇和风险，以及我们作为未来高中生物教师如何努力确保我们的学生获得对基因改造后果的尊重和理解。 CRISPR/Cas（成簇的规律间隔的短回文重复序列/CRISPR 相关）是在许多细菌和古细菌中发现的天然存在的适应性免疫防御系统。防御系统将一段外来核酸整合到特定的 CRISPR 基因座中。整合的序列在那里起到记忆的作用，使生物体对相同核苷酸序列的入侵具有免疫力。这是通过防御系统分解已识别的入侵核酸来实现的。 CRISPR/Cas 系统，尤其是 CRISPR/Cas9，如今可应用于各种生物的基因改造。 CRISPR/Cas 系统中自然存在的各种具有核酸酶活性的蛋白质可用于基因工程，在生物体基因组的特定位点造成双链断裂。双链断裂允许在裂解位点处进一步修饰核酸。尽管 CRISPR/Cas 技术在多个领域产生了巨大影响，但基因工程仍然存在很大的不确定性。人类、动物和植物生命的变化将对未来带来什么后果？因此，学校应向学生提供有关 CRISPR/Cas 的知识，并鼓励他们讨论基因工程的积极影响和风险所涉及的伦理困境。这可以让我们做出明智和深思熟虑的决定，决定现在和将来如何使用 CRISPR/Cas 来造福人类、动物和自然。
人类P2
寡脱氧核苷酸的杂交特性已经以多种技术为特征（1-4）。在适当条件下，寡核苷酸与DNA中的特定位点杂交（4，5）。此外，可以将完美的碱基配对的核苷酸双链体与包含单个不匹配的碱基对（4-6）的复式区分开。我们利用寡核苷酸的杂交特性在开发一种分离特定克隆的DNA序列的方法中（5）。我们的一般方法是化学合成寡核苷酸的混合物，这些寡核苷酸代表给定蛋白的一小部分氨基酸序列的所有可能的密码子组合。在该混合物中必须是与蛋白质该部分编码的DNA相结合的一个序列。这种互补的寡核苷酸将与来自蛋白质的编码区域的DNA形成完美的基础复式，而混合物中的其他寡核苷酸将形成不匹配的双链体。在严格的杂交结合下，只有完美匹配的双链体将形成，从而允许将寡核苷酸的混合物用作特定的杂交探针。混合序列寡核苷酸探针应允许分离出已知氨基酸序列的任何蛋白质的克隆DNA序列。我们已将这种方法应用于人A2-微球蛋白（AM）的克隆cDNA序列的分离。AM是一种从尿液中分离出来的小蛋白（分子量11,800）。随后，发现A3〜m与主要组织相容性基因座的细胞表面抗原相关（8、9）。A2M的确切功能尚不清楚，尽管最近的证据表明该分子可以稳定辅助蛋白的三级结构（10）。氨基酸序列已从包括人类在内的四个物种中定位为F2M（11）。我们已经使用氨基酸序列来设计探针，以分离到人类2M的克隆cDNA。
利用同源性独立的 CRISPR–Cas9 精准基因组编辑快速高效生成敲入人类类器官
类器官可通过诱导多能干细胞和胚胎干细胞的引导分化生成，也可从从成体组织中分离的细胞生成 1 。成体干细胞 (ASC) 衍生的类器官是自组织结构，可重现其来源的不同上皮组织的细胞组成、三维 (3D) 结构和功能的各个方面，同时保持基因组稳定性 2、3 。从转基因小鼠品系（尤其是敲入模型）中获得类器官的可能性使得能够生成工程化小鼠类器官，这些类器官已被用作多功能体外工具来回答各种生物学问题 4 3 10 。生成工程化人类 ASC 衍生类器官需要在建立品系后应用有效的体外基因组编辑策略。CRISPR3Cas9 技术大大简化了基因工程。迄今为止，这些方法主要限于非同源末端连接 (NHEJ) 介导的将插入/缺失引入类器官内源性基因座，从而导致基因突变 11 3 14 。通过利用 HDR 通路，引入单碱基替换来纠正囊性纤维化肠道类器官中的 CFTR 基因座 15 ，并且已经生成了一些人类 ASC 类器官敲入报告系，但主要是在结肠癌类器官中 16 3 18 。使用 HDR 的敲入利用了细胞修复双链断裂 (DSB) 的机制。可以使用 CRISPR3Cas9 在特定位点引入此类断裂。HDR 是用于靶向插入的最常用方法，但该过程效率低下并且要求细胞处于 S 期 19,20 。此外，HDR 需要克隆供体质粒，因为需要存在每个基因特有的同源臂（图 1a）。最近的研究表明，CRISPR 诱导的 DSB 可激活
小药大效：反义寡核苷酸在研究和药物开发中的非凡影响
摘要：反义寡核苷酸 (ASO) 是一种越来越常见的药物。这些小的核苷酸序列被设计成精确靶向其他寡核苷酸（通常是 RNA 物种），并经过修改以保护它们免受核酸酶降解。它们的特异性归因于它们的序列，因此可以靶向任何已知的 RNA 序列。这些分子非常灵活且适应性强，因为它们的序列和化学性质可以定制生产。根据所使用的化学性质，它们的活性可能会发生显著变化，并且它们对细胞功能和表型的影响可能会有很大差异。虽然有些会导致靶 RNA 衰变，但另一些只会与靶标结合并充当空间阻滞剂。它们令人难以置信的多功能性是操纵核酸功能的几个方面及其过程的关键，并改变特定细胞类型或组织的转录组谱。例如，它们可用于修改剪接或掩盖目标上的特定位点。整个设计（而不仅仅是序列）对于确保 ASO 针对其目标的特异性至关重要。因此，确保考虑到药物设计和测试的整个过程至关重要。ASO 的适应性是一个相当大的优势，在过去几十年中，它使多种新药获得批准。这反过来又对患者的生活产生了重大而积极的影响。鉴于 COVID-19 大流行带来的当前挑战，有必要找到新的治疗策略来补充全球正在使用的疫苗接种工作。ASO 可能是一种非常强大的工具，可用于靶向病毒 RNA 并提供治疗范例。ASO 作为抗病毒剂的有效性的证明由来已久，但目前尚无任何分子获得 FDA 批准。在这次健康危机期间，RNA 疫苗的出现和广泛使用可能为开发市场上首批抗病毒 ASO 提供了理想的机会。在这篇评论中，我们描述了 ASO 的故事、它们的化学不同特性以及它们的特性如何转化为研究和临床工具。
如何使用基因组编辑工具生成等位基因系列
基因组编辑工具极大地促进了通过靶向诱变对目标基因进行功能分析。现在有许多可用的基因组编辑工具，包括不同的位点特异性核酸酶和允许在给定位点引入单核苷酸多态性 (SNP) 的编辑器数据库。这些工具可用于在给定基因座产生高等位基因多样性，以促进基因功能研究，包括检查特定蛋白质结构域或单个氨基酸的作用。我们比较了我们的 LbCPF1、SpCAS9 和碱基编辑器 (BECAS9) 构建体对 OsCAO1 基因产生的效果、效率和突变类型。SpCAS9 和 LbCPF1 在产生突变方面具有相似的效率，但在诱导的突变类型上有所不同，对于 SpCAS9 和 LbCPF1，大多数变化分别是单核苷酸插入和短缺失。杂合子的比例也不同，在我们的 LbCPF1 中占大多数，而使用 SpCAS9，我们获得了大量双等位基因突变体。最后，我们证明了使用 BECAS9 可以特异性地引入终止密码子，可接受的效率约为 20%。基于这些结果，可以根据希望引入的突变类型在这三种替代方案中进行合理的选择，这三种系统是互补的。SpCAS9 仍然是在初级转化体中产生 KO 突变的最佳选择，而如果所需的基因突变干扰再生或生存能力，则将优先使用我们的 LbCPF1 构造，因为它主要产生杂合子。其他研究已将 LbCPF1 描述为在产生纯合和双等位基因突变方面与 SpCAS9 一样有效。未来仍有待澄清，不同的 LbCFP1 构造是否具有不同的效率并确定这些差异的来源。最后，如果希望专门引入终止密码子，BECAS9 是一种可行且有效的替代方案，尽管它在创建 KO 突变方面的效率低于 SpCAS9 和 LbCPF1。