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蜂胶化合物作为潜在的MMP1和MMP2抑制剂的活性在伤口愈合应用中的硅研究中
基质金属蛋白酶（MMP）是一种内肽，参与了伤口愈合的所有阶段。在炎症期间，MMP去除所有受损的蛋白质和临时ECM。在增殖阶段，MMPS降解毛细血管基底膜以促进血管生成和细胞迁移。同时，在组织重塑中，MMP活性降低并诱导重塑生长因子的释放。在这种情况下，金属蛋白酶（TIMP）的组织抑制剂通过与特定位点结合并防止ECM分解过度在平衡MMP活动中起关键作用（Ayuk等，2016; Kandhwal等人，2022年）。但是，在某些条件下，MMP和TIMP的失衡导致康复过程不佳。MMP1是一种显着的colla-基因，在血管起源期间在伤口部位表达。它在伤口愈合中重新排斥和迁移后，它作为真皮的重要组成部分降解。MMP1活动仅在关闭伤口之前有效，然后在重塑阶段自动关闭。然而，高水平的MMP-1与慢性伤口相关，并导致愈合时间延长（Muller等，2008）。例如，糖尿病足溃疡患者的MMP1大幅增加。MMP1/TIMP1的比率用作糖尿病足溃疡伤口愈合的预测因子。虽然比TIMP1的比率更高，但治疗效果越糟。先前的研究发现，慢性伤口渗出液的MMP水平高于急性伤口渗出液（Lobmann等，2002）。MMP12，一种金属弹性酶，在伤口愈合中也起着重要作用。它会破坏细胞外基质弹性蛋白，并使负责发炎和肉芽肿发育的免疫细胞浸润。MMP12对1型糖尿病患者的轻度炎症产生了影响。MMP12与1型糖尿病患者的轻度炎症有关，并在1型糖尿病患者的肠道损伤中与腹腔疾病呈正相关（Bister等，2005）。
目前有几种技术用于将 RNA 分子退火到其互补的 DNA 序列。为了某些目的，RNA 和 DNA 都可以
目前有几种技术可用于将 RNA 分子与其互补的 DNA 序列退火。对于某些目的，RNA 和 DNA 都可以在溶液中，1'2 但将 DNA 固定在固体或半固体基质中，4 或附着在硝酸纤维素膜过滤器上往往更方便。5 通常在用核糖核酸酶处理以去除未杂交的 RNA 后，通过对放射性 RNA 进行闪烁计数来检测杂交体。RNA 与细胞学制剂中的 DNA 的杂交应表现出高度的空间定位，因为每种 RNA 只与其互补的序列杂交。细胞学杂交技术的一般原理并不难制定。染色体或细胞核应以尽可能逼真的方式固定；碱性蛋白质应被去除，因为它们会干扰杂交过程；5 应以不丢失细胞完整性的方式变性 DNA；杂交应使用具有极高比活度的放射性 RNA，因为在给定位点杂交的分子数很少；检测应通过氚放射自显影实现最大细胞学分辨率。本文介绍了一种适用于传统南瓜制剂的细胞学杂交技术。它以蟾蜍 Xenopus 卵母细胞中 rRNA 与染色体外 rDNA 的杂交为例。1968 年 12 月，在巴西贝洛奥里藏特举行的国际核生理学和分化研讨会上提交了该技术的初步报告。材料和方法。- 细胞学杂交技术结合了琼脂柱4 和过滤方法5 的某些特点。它应该普遍适用于任何可以作为南瓜或涂片检查的材料。制备图 1 中所示的制剂时采用以下步骤。（1）将新近变态的非洲爪蟾的卵巢在乙醇-乙酸（3:1）中固定几分钟。（2）将组织转移到显微镜载玻片上的一滴 45% 乙酸中，
通过精准基因组编辑促进作物育种
全球气候变化以及不利的非生物和生物因素正在限制农业生产力，因此加大了作物科学家在满足全球粮食供应日益增长的需求方面面临的挑战。通过植物育种将应用遗传学引入农业，促进了杂交品种的开发，提高了作物的生产率。然而，利用现有基因库开发新品种对作物育种者来说是一个挑战。基因工程有可能通过将新基因引入作物来拓宽遗传多样性。但将外来 DNA 随机插入植物的核基因组通常会导致转基因沉默。植物育种领域的最新进展包括开发一种称为基因组编辑的新型育种技术。基因组编辑技术已经成为一种强有力的工具，可以在基因组的特定位点精确修改作物基因组，这一直是植物育种者的长期目标。目标基因组的精确修改、基因组编辑植物中不存在外来 DNA 以及基因组修改方法更快更便宜是基因组编辑技术的显著特点，导致其在不到十年的时间内广泛应用于作物育种。本综述重点介绍通过精准基因组编辑在作物育种方面的进展。本综述包括：作物改良的不同育种方法概述；基因组编辑工具及其作用机制和最广泛使用的基因组编辑技术 CRISPR/Cas9 在作物改良中的应用，特别是用于改良农艺性状，例如抗病性、非生物胁迫耐受性、除草剂耐受性、产量和品质提高、减少抗营养物质和延长保质期；以及基因组编辑作物监管部门批准的最新情况。本综述还为通过精准基因组编辑开发高产气候适应性作物提供了启示。
使用crispr/ttlbcas12a用于planta基因靶向A. thaliana
CRISPR/CAS系统通过诱导特定位点DNA双链断裂（DSB）启用基因编辑。但是，诱导的修饰的性质高度取决于用于DNA DSB修复的机制。非同源末端连接（NHEJ）介导的靶向诱变是由CRISPR/CAS诱导的一种已经标准应用的工具，可以在特定的基因组位点导致各种不同种类的突变。尽管如此，使用同源供体序列的精确基因组修饰仍然具有挑战性。的应用取决于较不频繁的同源重组（HR）需要进一步改进，以创建一种有吸引力的植物应用工具。着眼于这个问题，我们开发了植物基因靶向（IPGT）系统，该系统基于同时切除稳定集成的同源供体序列和目标位点中DSB的诱导。近年来，增强了基因靶向（GT）频率的几种改进。在为IPGT链球菌CAS9（SP Cas9）和金黄色葡萄球菌Cas9（SA Cas9）成功地促进了，我们能够使用lachnospileceae cas12a（lb cas12a）进一步改善该系统，这也可以在T-rich区域进行切割。 最近，我们测试了IPGT的LB CAS12A（TT LB CAS12A）的改进，耐温度的版本，并能够进一步提高GT效率。 在这里，我们详细介绍了使用TT LB Cas12a详细介绍最近发布的IPGT系统的实验程序。 ©2020作者。，我们能够使用lachnospileceae cas12a（lb cas12a）进一步改善该系统，这也可以在T-rich区域进行切割。最近，我们测试了IPGT的LB CAS12A（TT LB CAS12A）的改进，耐温度的版本，并能够进一步提高GT效率。在这里，我们详细介绍了使用TT LB Cas12a详细介绍最近发布的IPGT系统的实验程序。©2020作者。
评估带有纳米孔的8个字母扩展的脱氧核糖核酸字母的可读性
摘要：化学家现在已经合成了在标准Terran DNA中发现的四种标准核苷酸（鸟嘌呤，腺嘌呤，胞嘧啶和胸腺嘧啶）中添加核苷酸的新型DNA。今天在分子诊断中使用了这种“人为扩展的遗传信息系统”；支持定向进化以创建医学上有用的受体，配体和催化剂；并探索与生命早期演变有关的问题。进一步的应用受到无法直接序列DNA含有非标准核苷酸的限制。纳米孔测序非常适合此目的，因为它不需要酶促合成，扩增或核苷酸修饰。在这里，我们采取了第一步来实现8个字母“ Hachimoji”的纳米孔测序，通过使用MSPA（smegmacterium smegmatis porin a）纳米孔评估其纳米孔信号范围，扩展了DNA字母。我们发现Hachimoji DNA在纳米孔测序中表现出比单独标准DNA更广泛的信号范围，并且Hachimoji单碱基取代是可以高度置信的。由于纳米孔测序依赖于分子电机来控制DNA的运动，因此我们通过跟踪Hachimoji DNA的单个Hel308分子的易位来评估HACHIMOJI DNA的易位，从而评估了HACHIMOJI DNA的hel308运动酶与非标准核苷酸的兼容性，从而监测了酶基因酶的eNzeme disnzeme disnzeme disna。我们发现HEL308与Hachimoji DNA兼容，但是与N-糖苷相比，在C-糖苷核苷上行走时会更频繁地分离。c-糖化核苷通过HEL308中的特定位点会诱导更高的解离可能性。这强调了优化纳米孔测序电机以处理不同的糖苷键的需求。它还可以为未来的替代DNA系统的设计提供信息，这些系统可以与现有电动机和毛孔进行测序。
量子近似图切割
确定由基于温度的复制品交换分子动力学（T-REMD）完成的最佳蛋白质构型用于使用蛋白质结合分析，这是准确描绘蛋白质在不同溶剂环境中的行为的重要过程，尤其是在确定蛋白质最佳结合位点以在蛋白质粘结剂和蛋白质蛋白质中使用的最佳结合位点。然而，该分析的完成（通过配置变化推出了顶部绑定位点）是一个多项式状态计算问题，即使在最快的超级计算机上，也可能需要多个小时来计算。在这项研究中，我们旨在确定图形切割是否提供近似溶液，最大问题可以用作一种方法，以在确定表面活性剂蛋白A（SP-A）顶部结合位点（SP-A）的顶部结合位点进行结合分析，以提供与T-REMD相似的结果。此外，我们使用实际量子处理器单元（QPU）在IFF技术的Polar+软件包中使用量子混合算法，使用模拟QPU或量子抽象的机器（QAM）在大型经典计算设备上实现Polar+的实现，并在经典的MaxCut Algorith上实施，以确定超级Commuthm ge grom computige of grow of SuperComputimant of SuperComputime，以确定超级计算机的范围。用于此问题的量子计算设备，甚至在经典设备上使用量子算法。这项研究发现，Polar+对MaxCut近似算法的经典实现或GROMACS T-REMD的使用提供了巨大的加速，并在其QPU和QAM实现中产生可行的结果。然而，使用图切割方法后，缺乏直接构型变化在SP-A的结构上产生的最终结合结果与GROMACS T-REMD产生的结合结果不同。因此，需要完成进一步的工作，以将基于量子的概率转换为基于各种噪声条件的配置更改，以更好地确定量子算法和量子设备在不久的将来可以提供的准确性优势。
lbcas12a介导的棉叶卷曲的抑制作用
begomovirus具有传染性，并且严重影响了商业上重要的食物和粮食作物。棉叶卷曲的木木病毒（Clcumuv）是巴基斯坦棉花病毒最主要的特征之一，是对棉花产量的主要限制。目前，植物基因组编辑领域正在通过CRISPR/CAS系统应用（例如基础编辑，主要编辑和基于CRISPR的基因驱动器）进行革命。CRISPR/CAS9系统已成功用于模型和作物植物中的概念概念研究，以针对生物和非生物植物应力。CRISPR/CAS12和CRISPR/CAS13最近已在植物科学中应用于基础和应用研究。在这项研究中，我们使用了一种新型的方法，基于CRRNA的CAS12A工具箱，同时在多个位点靶向Clcumuv基因组的不同ORF。这种方法成功地消除了烟熏本尼亚娜和烟草的症状。从Clcumuv基因组设计了三个单独的CRRNA，针对四个不同ORF（C1，V1和C2和C3重叠区）的特定位点。基于CAS12A的构建体Cas12a-MV是通过金门三向克隆设计的，用于精确编辑Clcumuv Genome。cas12a-MV构建体是通过使用引物UBI-Intron-F1和M13-R1的整个基因组测序来确认的。通过农业纤维化方法，在4周大的尼古蒂亚纳本田植物中进行了瞬态测定。sanger测序表明，CAS12A-MV构建体在病毒基因组的靶位点上产生了相当大的突变。此外，对Sanger测序结果的潮汐分析显示了CRRNA1（21.7％），CRRNA2（24.9％）和CRRNA3（55.6％）的编辑效率。此外，Cas12a-MV构建体通过叶盘方法稳定地转化为烟草Tabacum，以评估转基因植物对Clcumuv的潜力。进行转基因分析，对烟草的转基因植物的DNA进行了PCR，以扩大具有特定底漆的Cas12a基因。传染性克隆在感染性测定中的转基因和非转基因植物（对照）中被农民接种。与具有严重症状的对照植物相比，含有Cas12a-MV的转基因植物表现出少数症状，并且保持健康。与对照植物相比，含有CAS12A-MV的转基因植物显示出病毒积累的显着降低（0.05）（1.0）。结果表明，多重LBCAS12A系统的潜在用途在模型和作物植物中针对贝诺维病毒中发展病毒抗性。
化学合成生物学的研究进展
[1] Switzer C，Moroney SE，Benner SA。将新碱基对酶促掺入DNA和RNA中。J Am Chem Soc，1989，111：8322-3 [2] Wang L，Brock A，Herberich B.扩大大肠杆菌的遗传密码。Science，2001，292：498-500 [3] Pinheiro VB，HolligerP。XNA世界：朝着复制和演变的进步合成遗传聚合物。Curr Opin Chem Biol，2012，16：245-52 [4] De Graaf AJ，Kooijman M，Hennink WE等。非天然氨基酸用于特定位点特异性蛋白质结合。Bioconjug Chem，2009，20：1281-95 [5] Schmidt M. Xenobiology：一种新的生活形式，作为最终的生物安全工具。Bioessays，2010，32：322-31 [6] Noren CJ，Anthony-Cahill SJ，Griffith MC等。一种将非天然氨基酸特异性掺入蛋白质中的一般方法。Science，1989，244：182-8 [7] Bain J，Switzer C，Chamberlin R等。 核糖体介导的非标准氨基酸通过遗传密码扩展到肽中。 自然，1992，356：537-9 [8] Matray TJ，Kool等。 DNA中无碱性损伤的特定伴侣。 自然，1999，399：704-8 [9] Hirao I，Kimoto M，Mitsui T等。 一种不自然的疏水基碱对系统：将核苷酸类似物特异性掺入到DNA和RNA中。 NAT方法，2006，3：729-35 [10] Wang W，Takimoto JK，Louie GV等。 遗传编码非天然氨基酸进行细胞和神经元研究。 nat Neurosci，2007，10：1063-72 [11] Leconte AM，Hwang GT，Matsuda S等。 J am Chem Soc，2008，130：2336-43Science，1989，244：182-8 [7] Bain J，Switzer C，Chamberlin R等。核糖体介导的非标准氨基酸通过遗传密码扩展到肽中。自然，1992，356：537-9 [8] Matray TJ，Kool等。DNA中无碱性损伤的特定伴侣。自然，1999，399：704-8 [9] Hirao I，Kimoto M，Mitsui T等。一种不自然的疏水基碱对系统：将核苷酸类似物特异性掺入到DNA和RNA中。NAT方法，2006，3：729-35 [10] Wang W，Takimoto JK，Louie GV等。遗传编码非天然氨基酸进行细胞和神经元研究。nat Neurosci，2007，10：1063-72 [11] Leconte AM，Hwang GT，Matsuda S等。J am Chem Soc，2008，130：2336-43发现，表征和优化不自然的碱基对，用于扩展遗传字母。
农杆菌介导的多重 CRISPR/...
摘要：在巴基斯坦，棉花作物占国内生产总值的 23%，其大量出口为贸易业务提供了 60% 的总利润。不幸的是，双子病毒以惊人的速度摧毁了棉花作物。现在，CLCuV 导致棉花作物发生棉花卷叶病毒病并降低其产量。这种病毒对棉花植物的攻击给巴基斯坦造成了 50 亿美元的损失。在这方面，使用了一些传统方法，如植物育种和特定的 RNA 编辑。同时，生物技术引入了一些非常有吸引力的技术，这些技术具有根除这种疾病的巨大潜力。这些技术包括 ZFN、TALEN 和 CRISPR/Cas9。在我的研究中，采用 CRISPR 方法是因为其具有出色的位点特异性诱变效率。不同 CLCuV 的 rep 基因的保守位置被确定为靶位点。这些特定位点为 3 个 gRNA 的建立提供了信息。克隆了具有多个引导RNA和1Cas9的单一表达载体pHSE-401。使用了特定的棉花品种coker-312。通过切除棉花植株的下胚轴并通过农杆菌EHA-105菌株进行传递感染来进行载体的转化。然后，将1000个感染性下胚轴转移到具有各自抗生素的MSB上，然后转移到将下胚轴边缘转化为愈伤组织的再生培养基上。仅获得两个转基因愈伤组织，转基因愈伤组织的百分比为0.02％，通过PCR筛选并在凝胶上进行电泳。200bp的条带证实了棉花愈伤组织中存在CRISPR/Cas9构建体。关键词：CRISPR/Cas9，多重载体，3gRNA和Cas9，农杆菌，转化，愈伤组织。版权所有 © 2020 作者：这是一篇开放获取的文章，根据知识共享署名 4.0 国际许可（CC BY-NC 4.0）分发，允许在任何媒体中无限制地使用、分发和复制，用于非商业用途，前提是注明原作者和出处。 1. 引言 巴基斯坦的经济主要依靠农业部门。其在 GDP 中的百分比为 19.82%，但农业部门的参与度从 1950 年的 50% 下降到 2014 年的 21% 左右。农产品、林业劳动力、牲畜养殖和农作物转化所赚取的收入养活了巴基斯坦 64% 的乡村人口。据统计，66% 的巴基斯坦人在农业部门就业。在 20 世纪的十年里，农产品的年增长率为 2.5%。在 1997 年的农业一揽子计划中，农作物产量增长了 5.9%。为了提高农业生产力，年产量从 2010 年的 0.2% 增加到 2015 年的 2.9%（匿名，2014-2015 年）。
表达胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器的 mRNA 可有效介导体内和体外碱基校正
通过特异性校正治疗遗传病的概念几十年来一直是生物医学领域的焦点。理想的解决方案是提供一种精确的方法来永久修复此类突变而不会引入新的错误。早期的基因编辑尝试涉及使用锌指核酸酶、TALEN 和 CRISPR-Cas9 核酸酶在特定位点引入双链断裂，以刺激与外源供体 DNA 模板的同源重组以纠正缺陷。然而，这些技术也会以高频率引入插入/缺失。在这里，我们评估了瞬时 mRNA 治疗引入永久性单碱基编辑的潜力。碱基编辑器通过创新的改良 Cas9 系统提供了在体内纠正单点突变的潜力。胞嘧啶碱基编辑器 (CBE) 使用与胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶 DNA 糖基化酶抑制剂融合的 Cas9 切口酶。当引导链将胞嘧啶-鸟嘌呤碱基对导向基因组中的特定位置时，小窗口中的胞嘧啶-鸟嘌呤碱基对会高效地转化为胸腺嘧啶-腺嘌呤对，且插入/缺失最少。同样，腺嘌呤碱基编辑器 (ABE) 使用实验室进化的与 Cas9 切口酶融合的脱氧腺苷脱氨酶将腺嘌呤-胸腺嘧啶碱基对转化为胞嘧啶-鸟嘌呤对。与基于核酸酶的方法相比，使用碱基编辑器可增加靶向编辑频率，同时大大减少脱靶插入/缺失的形成。与病毒载体和质粒相比，mRNA 具有以下主要优势：1) 降低载体整合风险；2) 能够编辑难以转染的非分裂细胞，因为 mRNA 靶标是细胞质而不是细胞核；3) 可在体内重复给药，这对于病毒载体来说具有挑战性，因为衣壳存在免疫反应；4) 瞬时表达，这对于最大限度提高基因组编辑应用的特异性非常理想。在这项研究中，我们比较了 HEK293 细胞中经过序列优化、化学修饰的 CBE 和 ABE mRNA。Western blot 分析显示，与未修饰的 mRNA 相比，经过 5-甲氧基尿苷修饰、经过序列优化的 mRNA 表达更高。在培养细胞中，mRNA 的编辑频率高于质粒载体。我们展示了使用一个碱基编辑器 mRNA 同时编辑多个位点以及编辑以前无法访问的基因组位点的能力。这些结果证明了碱基编辑技术的深远潜力。最后，我们开发了一种小鼠模型，使用注射到小鼠受精卵中的 BE4max 变体 mRNA，该模型将用于在未来的研究中测试体内 ABE 校正。