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World File Search System定向诱变
1 2 蒺藜苜蓿根瘤的定向诱变——...
1 2使用农业杆菌的诱变特异性半胱氨酸（NCR）基因3植物生物学，生物学研究中心，EötvösLóránd研究网络，匈牙利12 SZEGED，匈牙利13 2遗传学和生物技术研究所，匈牙利农业与生命大学14科学14科学，匈牙利15 16 17 16 17 16 17 18 19 20 20 20 21 21 22 22 23 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 25 2 25 29 * bg and jb and jud撰写。 30 31 通讯作者：Péter Kaló，电子邮箱：kalo.peter@brc.hu 32 33 ORCID ID： 34 35 Peter Kalo：0000-0002-0404-8904 36 Berivan Güngör：0000-0002-5612-1130 37 János Barnabás Biró：0000-0001-8851-0387 38 Agota Domonkos：0000-0003-4017-0605 39 Beatrix Horvath：0000-0001-8499-568X 40 41 42 43
蒺藜苜蓿根瘤的定向诱变——...
去除未转化根并在 4-7 周后对转化植物的共生表型进行评分（图 4）。用空载体或靶向 NCR068 的构建体转化的植物的地上部分没有表现出氮缺乏的症状（图 1a、c），用靶向基因 NCR089、NCR128 和 NCR161 的构建体转化的植物表现出相似的生长习性（未显示数据），表明这些植物具有有效的共生固氮能力。用四种选定 NCR 的 sgRNA 构建体转化的根上形成的根瘤细长且呈粉红色，表明它们是功能性根瘤（图 4j、l、n、p）。用 SYTO13 对根瘤切片进行染色，结果显示，针对基因 NCR068、NCR089、NCR128 和 NCR161 诱变的根瘤的细菌定植与在空载体转化的
通过内源启动子进行有效的定向诱变……
和缺失分别以+和-表示。i 使用酶StuI对T0纯合突变体进行限制性消化筛选。野生型Solanum etuberosum产生消化的PCR带（蓝色箭头），而突变植物产生对StuI消化有抗性的PCR带。J、k CR-SeSP5G突变体在短日照条件下开花，而野生型在短日照条件下不能开花。比例尺：1厘米；NF，无花。
微生物多个染色体区域的定向诱变
定向进化可以有效地改造蛋白质、生物合成途径和细胞功能。传统的基于质粒的方法通常对一个或偶尔多个感兴趣的基因进行诱变，需要耗时的人工干预，并且进行诱变的基因在其原生基因组背景之外。其他方法不加选择地诱变整个基因组，这可能会扭曲结果。最近的重组工程和基于 CRISPR 的技术通过允许在其原生基因组背景下的多个预定位点上实现极高的突变率，从根本上改变了这一领域。在这篇综述中，我们重点介绍了最近的技术，这些技术可能允许在这些目标序列的原生基因组背景下在多个基因组位点上加速可调诱变。这些技术将通过四个主要标准进行比较，包括诱变规模、对多种微生物物种的可移植性、脱靶诱变和成本效益。最后，我们讨论这些技术进步如何为基础研究和生物技术开辟新的途径。
CRISPR/Cas9 介导的日本柳杉 (Cryptomeria japonica D. Don) 定向诱变
明显分为阳性和阴性；根据我们的观察，没有子叶表现出嵌合 GFP 荧光（图 4a-j）。在具有活性 GFP 的绿色发芽体细胞胚中，由于叶绿素自发荧光强，几乎观察不到 GFP 荧光；相反，在胚基部的愈伤组织中观察到 GFP 荧光（图 4d，i）。为了研究子叶体细胞胚中的嵌合性，使用 8-30 个子叶胚（来自 6 个品系的 139 个）进行了测序分析。来自品系#47-2 的一个子叶胚在一个体细胞胚中有两种修饰模式。然而，在其他品系中，突变模式在单个子叶胚中明显分开（图 4k）。接下来，通过分析 4 个品系（分别为 #42 - 2、#18、#31 - 2 和 #11）中各 10 个通过体细胞胚胎发生再生的幼苗，分析了突变模式的稳定性。
大麦脑膜炎黄杆菌脯氨酰寡肽酶和谷氨酰胺特异性内肽酶的定向诱变
小麦麸质蛋白是已知的乳糜泻病因。这些蛋白质中脯氨酸和谷氨酰胺残基的重复序列使其在胃肠道中具有极强的抗消化性。这些未消化的肽会引发易感个体的免疫反应，这可能是过敏反应或乳糜泻。麸质排除饮食是此类疾病的唯一获批疗法。最近，大麦中的谷氨酰胺特异性内切蛋白酶 (EP-B2) 和脑膜炎黄杆菌中的脯氨酰内切肽酶 (Fm-PEP) 的组合在小麦胚乳中表达时，在模拟胃肠道条件下被证明可以合理地解毒免疫原性麸质肽。尽管这些“麸质酶”很有用，但它们的应用受到限制，因为它们在高温下会变性，而大多数食品加工都需要高温。这些酶的变体来自嗜热生物，但由于其最佳活性在高于 37 ◦ C 的温度下存在，因此不能直接应用。不过，这些酶可以作为参考，指导中温来源的肽酶向热稳定性进化。因此，这里使用序列引导的位点饱和诱变方法在编码 Fm-PEP 和 EP-B2 的基因中引入突变。使用这种方法鉴定出能够在高达 90 ◦ C 的温度下存活的 Fm-PEP 的热稳定性变体和热稳定性高达 60 ◦ C 的 EP-B2 变体。然而，达到的热稳定性水平还不够；本研究提供了可以提高谷蛋白酶热稳定性的证据。并且这项初步研究为未来更详细的结构研究奠定了基础，以获得可以在 ∼ 100 ◦ C 温度下存活的 Fm-PEP 和 EP-B2 变体，从而可以将其包装在谷物中并将此类谷物用于食品工业。
利用冲击波介导的核糖核蛋白递送对烟草 ADF 基因进行定向诱变，提高渗透胁迫耐受性
建立了工作流程后，我们随后使用脉冲激光诱导冲击波法将 RNP 直接递送到完整的烟草叶片细胞中，这比原生质体或受精卵更容易制备和处理。我们引入了一个预组装的 RNP，它包含 HiFi Cas9 蛋白、crispr RNA (crRNA) 和 ATTO-550 标记的反式激活 crispr RNA (tracrRNA)，靶向烟草 PDS 或 ADF 基因。荧光 tracrRNA 允许直接筛选转染细胞，因此不需要选择标记基因（图 2A'）。样本大小和实验设置与上面描述的 DsRed 转染相同（图 1A、B）。根据我们的观察，ATTO-550 荧光在激光处理后 24 小时开始变得可见，在转染后 48 小时达到最大值。根据制造商的说法，RNP 复合物的活性最长为 72 小时。
P9_TA(2024)0067 – 通过某些新型基因组技术获得的植物及其食品和饲料 – 欧洲议会于 2024 年 2 月 7 日通过的关于欧洲议会和理事会关于通过某些新型基因组技术获得的植物及其食品和饲料的条例提案的修正案，以及对 (EU) 2017/625 条例的修订 (COM(2023)0411 – C9-0238/2023 – 2023/0226(COD))（普通立法程序：一读）
(2) NGT 是一组不同的基因组技术，每一种技术都可以以不同的方式使用，以实现不同的结果和产品。它们可以产生与传统育种方法获得的生物体相同的修饰，也可以产生具有更复杂修饰的生物体。在 NGT 中，定向诱变和同源基因（包括基因内杂交）引入遗传修饰，而无需插入不可杂交物种的遗传物质（转基因）。它们仅依赖于育种者的基因库，即可用于常规育种的全部遗传信息，包括可通过先进育种技术杂交的远亲植物物种。定向诱变技术可对生物体基因组中精确位置的 DNA 序列进行修饰。同源基因技术可将育种者基因库中已经存在的遗传物质插入生物体基因组中。内部遗传是同源遗传的一个子集，其结果是在基因组中插入由育种者基因库中已经存在的两个或多个 DNA 序列组成的重排遗传物质拷贝。
欧洲议会通过的文本
(2) NGT 是一组不同的基因组技术，每一种技术都可以以不同的方式使用，以实现不同的结果和产品。它们可以产生与传统育种方法获得的生物体相同的修饰，也可以产生具有更复杂修饰的生物体。在 NGT 中，定向诱变和同源遗传（包括同源遗传）引入遗传修饰，而无需插入不可杂交物种的遗传物质（转基因）。它们仅依赖于育种者的基因库，即常规育种可用的全部遗传信息，包括可以通过先进育种技术杂交的远亲植物物种。定向诱变技术可对生物体基因组中精确位置的 DNA 序列进行修饰。同源遗传技术可将育种者基因库中已经存在的遗传物质插入生物体的基因组中。同源遗传是顺源遗传的一个子集，其结果是在基因组中插入由育种者基因库中已经存在的两个或多个 DNA 序列组成的重新排列的遗传物质副本。
使用生殖细胞的基因组编辑方法/......
通过可编程核酸酶（包括成簇调控间隔短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9) (CRISPR/Cas9) 系统）进行的定向诱变已被广泛用于生成基因组编辑生物，包括开花植物。迄今为止，在生殖细胞或组织中特异性表达 Cas9 蛋白和向导 RNA (gRNA) 被认为是可遗传定向诱变最有效的基因组编辑方法之一。在本报告中，我们回顾了生殖细胞或组织的基因组编辑方法的最新进展，这些细胞或组织在将遗传物质传递给下一代方面发挥着作用，例如卵细胞、花粉粒、合子、未成熟合子胚和茎尖分生组织 (SAM)。 Cas9 蛋白在起始细胞中的特异性表达可有效诱导农杆菌介导的植物转化中的靶向诱变。此外，通过将 CRISPR/Cas9 成分直接递送到花粉粒、受精卵、胚胎细胞和 SAM 中，已成功建立基因组编辑，以生成基因组编辑的植物系。值得注意的是，通过递送 Cas9-gRNA 核糖核蛋白 (RNP) 进行的无 DNA 基因组编辑与任何有关转基因生物的立法问题无关。总之，生殖细胞或组织的基因组编辑方法不仅对植物生殖的基础研究具有巨大潜力，而且对分子植物育种的应用科学也具有巨大潜力。