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World File Search System定向诱变
葡萄灰霉病
葡萄（Vitis vinifera L.）是世界主要水果作物之一。葡萄的生产受到许多疾病的严重影响，包括由死体真菌灰葡萄孢引起的灰霉病。虽然所有葡萄属物种都可以成为灰葡萄孢的宿主，但葡萄属葡萄孢特别容易感染。因此，这种疾病对葡萄产业构成了重大威胁，并造成了巨大的经济损失。抗性葡萄属葡萄品种的开发已经从农民的偶然选择发展到通过使用统计和实验设计的有针对性的选择，再到使用遗传和基因组数据。标记辅助选择和基因工程等新兴技术促进了对灰葡萄孢具有抗性的品种的开发。一种有前途的方法是使用 CRISPR/Cas9 系统诱导定向诱变并开发转基因非转基因作物。因此，科学家现在正积极寻求识别与易感性和抗性相关的基因。本综述重点介绍 B. cinerea 病原体与其葡萄寄主之间的已知相互作用机制。它还探讨了 V. vinifera 中进化的先天免疫系统，目的是促进抗性葡萄品种的快速发展。
加纳基因组编辑应用指南.pdf
基因组编辑是对生物体基因组核苷酸序列进行精确的靶向修改。基因组编辑 (GE) 技术正在迅速开发和部署，以服务于农业和粮食生产目标，从而改善农作物和其他产品。该过程涉及精确删除、替换或插入单个或有限数量的核苷酸。基因组编辑的生物体可以具有来自相同或不同物种的脱氧核糖核酸 (DNA) 片段。有许多工具被描述为“基因组编辑技术”。也许最广泛使用的工具是成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)Cas（CRISPR 相关蛋白），但 GE 还指其他方法，如寡核苷酸定向诱变 (ODM)、转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN)、锌指核酸酶 (ZFN) 和巨核酸酶，以及这些技术的变体。无论是使用传统育种方法、重组 DNA 技术还是 GE 技术，都可能会发生一些遗传变化。遗传变化的速度因物种而异，有些方法引入的变化比其他方法更多。可以故意刺激随机遗传变化以增加遗传变异，就像随机诱变技术一样。随机基因变化可能是无声的（没有可观察到的影响），从而产生在育种计划中选择的理想特性或组合，或者可能导致不理想的意外影响，并且会从育种计划中消除。
难以转化是豆科植物基因组编辑的障碍
植物基因组编辑是最近发现的一种定向诱变方法，已成为作物改良和基因功能研究的有前途的工具。过去十年中，许多基因组编辑植物已经出现，例如水稻、小麦和番茄。由于基因组编辑程序的初步步骤涉及基因转化，因此基因组编辑的适应性取决于基因工程的效率。因此，关于上述作物的报道很多，因为它们相对容易转化。豆科作物富含蛋白质，因此是大多数国家人类饮食中植物蛋白质的首选来源。然而，豆科植物的种植经常受到各种生物/非生物威胁，从而导致高产量损失。此外，某些豆科植物（如花生）含有过敏原，需要消除这些过敏原，因为它们剥夺了许多人从此类作物中获得好处的权利。某些豆科植物的进一步遗传变异有限。基因组编辑不仅可以提供对抗生物/非生物胁迫的解决方案，还可以产生理想的敲除和遗传变异。然而，除大豆、苜蓿和日本莲花外，关于其他豆科作物基因组编辑的报道较少。这是因为，除上述三种豆科作物外，大多数豆科植物的转化效率都很低。获得更多的基因组编辑事件是可取的，因为它提供了根据基因型/表型选择最佳候选者的选项，而没有脱靶突变的负担。消除基因工程的障碍将直接有助于提高基因组编辑率。因此，本综述旨在比较各种豆科植物的转化、编辑和再生效率，并讨论可用于提高豆科植物转化和基因组编辑率的各种解决方案。
全基因组 CRISPR 筛选及其在传染病中的应用
基因失活或靶向破坏为评估基因在许多细胞过程中的功能提供了线索。基因敲除或敲除已被广泛用于此目的。然而，最近 CRISPR 介导的基因组编辑以更高的精度取代了敲除/敲除系统。CRISPR 技术使我们能够进行定向诱变或基因组编辑，以解决从基础生物学到生物医学研究的问题。它在理解基因在疾病过程中的作用以及对癌症、代谢紊乱或传染病治疗的反应方面应用广泛。在本文中，我们重点关注传染病以及全基因组 CRISPR 筛选如何使我们能够识别感染过程中涉及的宿主因素。了解宿主-病原体相互作用的生物学对于规划宿主导向治疗以改善疾病的更好管理至关重要。全基因组 CRISPR 筛选提供了强大的机制方法来识别各种感染中涉及的宿主依赖性因素。我们介绍了在病毒和细菌传染病背景下进行的全基因组 CRISPR 筛选的见解，从而更好地了解了宿主-病原体相互作用和免疫网络。我们讨论了有关流感病毒、不同肝炎病毒、艾滋病毒、最近的 SARS CoV2 等知识的进步。在细菌性疾病中，我们重点关注危及生命的分枝杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等感染。看来 CRISPR 技术可以普遍应用于多种传染病模型，以揭示已知或新的宿主因素的作用。
谷氨酸作用于酸性离子通道，导致缺血性脑损伤
谷氨酸传统上被视为第一个激活NMDAR（N-甲基-D-天冬氨酸受体）依赖性细胞死亡途径1,2中的细胞死亡途径，但使用NMDAR拮抗剂进行了不成功的临床试验，暗示了其他机制3-7的参与。在这里，我们表明谷氨酸及其结构类似物，包括NMDAR拮抗剂L-AP5（也称为APV），通过与酸中毒诱导的中风中神经毒性相关的酸性离子通道（ASICS）介导的稳健性电流4。谷氨酸增加了ASIC对质子的亲和力及其开放概率，从而在体外和体内模型中加剧了缺血性神经毒性。定向诱变，基于结构的建模和功能测定法显示ASIC1A外细胞外结构域中的真正的谷氨酸结合腔。计算药物筛选确定了一个小分子LK-2，该分子与该空腔结合并废除了ASIC电流的谷氨酸依赖性增强，但避免了NMDARS。lk-2减少了缺血性中风的小鼠模型中的梗塞体积并改善了感觉运动恢复，让人联想到在ASIC1A敲除或其他阳离子通道4-7的小鼠中看到的。我们得出的结论是，谷氨酸是ASIC的阳性变构调节剂，以加剧神经毒性，并优先针对NMDARS上的ASIC上的谷氨酸结合位点靶向，以开发NMDAR Antagonist的精神病性副作用，以开发中风治疗。
CRISPR-Cas9 介导的精准微生物基因组编辑，借助目标错配的 sgRNA
CRISPR-Cas9 系统彻底改变了基因组编辑。CRISPR-Cas9 由单分子向导 RNA (sgRNA) 和蛋白质 Cas9 核酸酶组成，后者可识别特定靶序列和原型间隔区相邻基序 (PAM) 序列，然后切割目标 DNA 序列。该 CRISPR-Cas9 系统已被用作有效的负选择工具，用于在位点特异性诱变过程中切割未编辑或未改变的靶 DNA，从而获得具有所需突变的微生物细胞。本研究旨在调查 CRISPR-Cas9 系统在细菌体内寡核苷酸定向诱变中的基因组编辑效率。该系统成功地在大肠杆菌的 galK 中引入了 2 到 4 个碱基的突变，编辑效率很高 (81% − 86%)。然而，单点突变（T504A 或 C578A）很少引入，并且编辑效率非常低（<3％），这可能是由于错配耐受性所致。为了解决这个问题，我们在 sgRNA 序列中设计了一个或两个碱基的错配，以识别大肠杆菌中 galK 的靶序列。使用单碱基错配的 sgRNA，在 36％−95％ 的负向选择的大肠杆菌细胞中成功引入了单点核苷酸突变（galK 基因中的 T504A 或 C578A）。通过使用错配的 sgRNA 的全基因组单碱基编辑实验，随机选择了 16 个靶标。因此，在 48 个所需的单碱基突变中，使用错配的 sgRNA 成功编辑了 25 个单碱基。最后，为微生物基因组中的单核苷酸编辑提供了适用的靶标错配 sgRNA 设计规则。
CRISPR Cas9 编辑多聚半乳糖醛酸酶 FaPG1 ...
硬度是草莓最重要的果实品质性状之一。这种软果实采后保质期在很大程度上受到硬度损失的限制，而细胞壁的分解起着重要作用。先前的研究表明，多聚半乳糖醛酸酶 FaPG1 在草莓软化过程中对果胶的重塑起着关键作用。在本研究中，使用农杆菌传递的 CRISPR/Cas9 系统生成了 FaPG1 敲除草莓植株。获得了 10 个独立品系 cv.“Chandler”，经 PCR 扩增和 T7 内切酶测定确定所有品系均已成功编辑。使用靶向深度测序分析了定向诱变插入和删除率。编辑序列的百分比从 47% 到几乎 100% 不等，其中 7 个选定品系的编辑序列百分比高于 95%。表型分析表明，在所分析的 8 个品系中，有 7 个品系产生的果实明显比对照更坚硬，硬度增加了 33% 到 70%。 FaPG1 编辑程度与果实硬度增加呈正相关。其他果实品质特征（如颜色、可溶性固体、可滴定酸度或花青素含量）的变化很小。编辑后的果实在采后软化率降低，蒸腾水分损失减少，受灰葡萄孢菌接种的损害较小。对四个潜在脱靶位点的分析未发现突变事件。总之，使用 CRISPR/Cas9 系统编辑 FaPG1 基因是提高草莓果实硬度和保质期的有效方法。
靶向敲除真核翻译起始因子4E使冬大麦获得对丝状病毒的抗性
真核翻译起始因子 4E (EIF4E) 是许多植物物种中马铃薯病毒感染的已知易感因子。大麦黄花叶病毒病是由大麦黄花叶病毒 (BaYMV) 和大麦温和花叶病毒 (BaMMV) 引起的，可导致冬大麦产量损失高达 50%。秋季，幼小的大麦植株的根部被土传的根瘤寄生虫 Polymyxa graminis L. 感染，该寄生虫是病毒载体。病毒建立并系统性扩散到植物上部后，叶子上首先出现黄色花叶。在植物进一步发育的过程中，该病会导致叶子坏死，并且更易受霜冻伤害。由于 HvEIF4E 基因的 rym4 和 rym5 等位基因变体，超过三分之二的欧洲冬大麦品种对 BaYMV 和 BaMMV 具有抗性。然而，几种 BaYMV 和 BaMMV 菌株已经克服了 rym4 和 rym5 介导的抗性。因此，大麦育种需要新的抗性等位基因。因此，我们在 BaMMV/BaYMV 易感冬大麦品种“Igri”中通过 Cas9 内切酶对 EIF4E 基因进行了定向诱变。产生了小插入，导致翻译阅读框发生移位，从而导致 EIF4E 功能丧失。突变发生在原代突变体中已经处于纯合状态。它们的后代被证明总是纯合的并且完全抵抗 BaMMV 的机械接种。EIF4E 敲除植物表现出正常的生长习性并产生谷物，但产量受损。
通过向玉米幼苗顶端分生组织注射寡核苷酸进行定向细胞诱变的植物体内测试系统
摘要 从寡核苷酸定向诱变 (ODM) 到 CRISPR 系统，基因组编辑工具都使用合成寡核苷酸进行核苷酸的靶向交换。目前，大多数基因组编辑方案依赖于具有体细胞克隆变异和植物再生限制的体外细胞或组织培养系统。因此，我们在此报告了一种用于优化 ODM 的替代植物细胞测试系统，该系统基于将寡核苷酸溶液注射到单倍体玉米幼苗的顶端分生组织区域。使用 5′-荧光素标记的寡核苷酸，我们检测到合成 DNA 分子在茎尖分生组织细胞和叶原基维管束中的积累。为了沉默或敲低体细胞中的八氢番茄红素去饱和酶基因，将带有 TAG 终止密码子的 41 碱基长的单链寡核苷酸注射到玉米幼苗中。我们检测到长出的 M1 幼苗长出了带有白色条纹或浅绿色的叶子。白色条纹的共聚焦显微镜显示，除了叶绿素荧光缺乏的组织区域外，白色条纹中还存在含叶绿素的细胞。对白色条纹的 DNA 样本进行 Ion Torrent 测序表明，八氢番茄红素去饱和酶基因中的 TAG 终止密码子的读取频率为 0.13–1.50%。在将寡核苷酸分子注射到玉米幼苗的茎尖分生组织区域后，出现褪绿异常支持了寡核苷酸分子的诱变性质。所述方案为在幼苗早期阶段表征具有不同化学性质的诱变寡核苷酸的功能以及在植物水平上测试各种处理组合的效率提供了基础。
通过改造 EpiC2B 增强晚疫病抗性
木瓜蛋白酶样免疫蛋白酶 (PLCP) 是作物保护的有希望的工程目标，因为它们在番茄、玉米和柑橘等主要作物的植物免疫中发挥着重要作用 (Misas-Villamil 等人，2016 年)。病原体分泌的 PLCP 抑制剂种类繁多，凸显了这些蛋白酶在防御各种病原体方面的重要性。例如，番茄中质外体免疫 PLCP 疫霉菌抑制蛋白酶 1 (Pip1) 的消耗会导致对细菌、真菌和卵菌番茄病原体的超敏性 (Ilyas 等人，2015 年)。然而，Pip1 在野生型番茄中的免疫力并不理想，因为 Pip1 在感染过程中受到多种病原体分泌的抑制剂的抑制，例如来自卵菌晚疫病原体 Phytophthora infestans 的胱抑素样 EpiC2B (Tian 等人，2007)。在这里，我们测试了是否可以通过将 Pip1 改造成 EpiC2B 不敏感的蛋白酶来增加基于 Pip1 的对晚疫病的免疫力。为了指导 Pip1 诱变，我们使用 AlphaFold-Multimer 生成了 EpiC2B-Pip1 复合物的结构模型 (Evans 等人，2022)。该结构模型代表了胱抑素 (EpiC2B) 的三部分楔与木瓜蛋白酶 (Pip1) 的底物结合槽之间的经典相互作用。该模型表明，由于 Pip1 与 EpiC2B 的相互作用表面大于底物结合槽，因此可以对 Pip1 进行工程改造以防止抑制，而不会影响 Pip1 底物特异性（图 1a）。我们选择了九个残基对 Pip1 进行定向诱变，这些残基预计会直接与 EpiC2B 相互作用，但不在底物结合槽中（图 1a）。为了最大程度地破坏蛋白酶-抑制剂相互作用，我们将这些残基替换为带相反电荷的大氨基酸。随后