有针对性的基因组编辑具有治疗需要蛋白质替代疗法的疾病的巨大治疗潜力。为了开发独立于特定患者变形的平台,可以将治疗转基因插入安全且高度转录的基因座,以最大程度地提高蛋白质表达。在这里,我们描述了一种实现人类造血干/祖细胞(HSPCS)中有效基因靶向有效基因的方法,并通过红细胞动力学谱系对临床相关蛋白质的鲁棒表达。使用CRISPR-CAS9,我们在内源性α-珠蛋白启动子的转录控制下整合了不同的转基因,从而概括了其高和红细胞的特异性表达。源自靶向HSPC的促成的细胞分泌不同的治疗蛋白,该蛋白保留了酶活性和交叉校正患者细胞。此外,修饰的HSPC在移植小鼠中保持长期重生和多系分化潜力。总的来说,我们为不同的治疗应用(包括血友病和遗传的代谢疾病)建立了一个安全且通用的基于CRISPR-CAS9的HSPC平台。
基因改造单细胞的同质性对于许多应用(例如细胞系开发、基因治疗和组织工程,尤其是再生医学应用)而言是必需的。缺乏有效分离和表征 CRISPR/Cas9 工程细胞的工具被认为是这些应用中的一个重大瓶颈。尤其是蛋白质检测技术不兼容,无法在没有先决条件大规模克隆扩增的情况下确认蛋白质表达变化,这在许多应用中造成了僵局。为了改善工程细胞的表征,我们提出了一种改进的工作流程,包括基于高产量荧光特性的单细胞打印/分离技术、基因组编辑筛选(测量测定)、评估改变的基因表达的 mRNA rtPCR 和一种称为乳化偶联的多功能蛋白质检测工具,以提供高含量、统一的单细胞工作流程。该工作流程以 RANKL 敲除永生化间充质干细胞的工程和功能验证为例,这些细胞的骨形成能力发生了改变。由此产生的工作流程经济实惠,无需大规模克隆扩增细胞,整体克隆效率高于 CRISPR/Cas9 编辑细胞的 30%。尽管如此,由于单细胞克隆在细胞发育的早期高度并行阶段得到全面表征,包括 DNA、RNA 和蛋白质水平,因此该工作流程可提供更多成功编辑的细胞以供进一步表征,从而降低开发过程中后期失败的可能性。
该方案概述了干细胞衍生神经祖细胞的冷冻保存程序。它可用于在液氮罐中分化的第13天或第17天的腹中脑中脑多巴胺神经元祖细胞的冷冻保存和长期存储。
Inhibitor Target Source Concentration used AZD5363 Akt Tocris Bioscience 1 uM Crizotinib cMet Selleckchem 1 uM Erlotinib EGFR Selleckchem 1 uM Elastatinal Elastase Sigma 100 ug/mL Infigratinib FGFR Prof. Davd Fernig 1 uM AG1024 IGFR Sigma 10 uM Trametinib MEK1/2 Selleckchem 1 uM RAPAMYCIN MTOR SELLECKCHEM 1 UM IMATINIB PDGFR SELLECKCHEM 1 UM WORTMANIN PI3K SIGMA SIGMA 0.1 UM PAZOPANIB VEGFFR SELLECKCHEM 1 UM
。cc-by-nd 4.0国际许可证。是根据作者/资助者提供的预印本(未经同行评审认证)提供的,他已授予Biorxiv的许可证,以在2025年2月26日发布的此版本中在版权所有者中显示预印本。 https://doi.org/10.1101/2025.02.23.639689 doi:Biorxiv Preprint
特异性和评论识别CD3的Epsilon链,该链由MW的五个不同的多肽链(指定为Gamma,Delta,Epsilon,Zeta和Eta),MW为16-28KDA。CD3通常在高水平上表达在外周T细胞和大多数T细胞肿瘤上。胸腺细胞在分化过程中在细胞表面的不同水平上表达CD3,在皮质胸腺中,CD3主要是胞质内的。CD3复合物在淋巴细胞细胞表面与T细胞抗原受体(TCR)紧密相关,并参与将抗原识别信号转导到T细胞的细胞质中以及调节TCR复合物的细胞表面表达。
特异性和评论此mAb识别〜50KDA的蛋白质,该蛋白质被识别为神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)。它与其他中间丝蛋白没有交叉反应。GFAP在星形胶质体中特异性发现。GFAP是在中枢神经系统中定位良性星形胶质细胞和神经胶质起源的肿瘤细胞的非常流行的标记。对GFAP的抗体可用于区分大脑的转移性病变,并记录中枢神经系统外肿瘤的星形细胞分化。
间充质基质细胞(MSC)是人体各种组织中存在的异质细胞种群,已知具有免疫调节和调节性能。他们导航到体内受伤和炎症的部位的能力使他们在开发再生治疗和药物方面受到了极大的追捧。