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内部DNA提取控制
执行DNA提取时，具有将DNA模板的外源性来源[裂解缓冲液带到裂解缓冲液中通常是有利的。然后将此对照DNA与样品DNA共纯化，可以被检测为提取过程的阳性对照（内部提取对照）。对照DNA的成功共纯化和实时PCR扩增还表明，PCR抑制剂不存在高浓度。另外，该试剂盒中的DNA可以直接[直接确认测试样品都有能力支持qPCR扩增（内部PCR控制）。使用该套件提供单独的引物/探针混合物，以使用qPCR检测外源DNA。引物以PCR极限浓度存在，该浓度允许与靶序列引物进行多功能。对照DNA的扩增即使以低拷贝数存在靶基因，也不会干扰靶基因的检测。可用多种不同的染料，因此可以使用一系列通道来检测控制DNA。应选择通过单独的靶基因通道读取的染料。
基因分型
或者，您可以使用依赖于 Sanger 测序的 EditCo 的 CRISPR 编辑推断 (ICE) 工具来分析单指导、多指导和敲入 CRISPR 编辑。值得注意的是，EditCo 的 ICE 工具目前是分析多指导衍生的 CRISPR 编辑的唯一公开可用选项。CRISPR 编辑推断 (ICE) 工具是一款免费的在线软件，可分析 Sanger 测序数据以确定编辑效率。在使用 ICE 之前，必须准备编辑和对照 DNA 样本进行 Sanger 测序。该协议提供了如何设计引物、分离基因组 DNA 和进行 PCR 的说明。这些说明可用于每个靶标使用一个 sgRNA（或 cr:tracr）或每个靶标使用多个 sgRNA（即 EditCo 的多指导设计）的敲除实验。该协议也可用于敲入实验。如果您需要 Sanger 测序引物，可以联系 Technicalsupport@editco.bio。请注意，Sanger 引物建议是使用标准生物信息学算法计算得出的。EditCo 并未对其进行功能验证。
具有GAPDH参考基因的新型实时PCR，用于反刍动物
摘要：Peste des Petits反刍动物（PPR）是一种严重的急性，高度传染性的疾病，是由Peste des Petits反刍动物病毒（PPRV）引起的。本研究旨在建立具有内部扩增对照的QRT-PCR测定，以快速准确地检测PPRV。PPRV N的引物和探针基于中国PPR诊断技术的国家标准，设计了一对引物和TAQ MAN探针，用于设计甘油醛-3-磷酸盐脱氢酶（GAPDH）的参考基因。进行了反应条件，特异性，灵敏度和可重复性测试以及临床样本检测的优化。结果表明，对于参考基因GAPDH的最佳引物和探针浓度分别为0.4μmol/L和0.4μmol/L，分别为0.4μmol/L和0.2μmol/L。已建立的方法与其他病毒没有交叉反应。PPRV的最小检测极限为6.8副本/µl，GAPDH的副本为190份/µL。PPRV和GAPDH的变异系数（CV％）都低于2％。结果表明，包含内部参考基因的PPRV QRT-PCR方法具有很强的特异性，高灵敏度和良好的可重复性。添加用于样品质量控制的内部参考基因可提高检测的准确性。
Physcomitrium开放CSLD功能分析 div>
由于其小基因组和主要的单倍体生命阶段，Physcomitrium Patens（以前是Physcomitrella Patens）已成为研究植物遗传学的模型生物。这项研究的重点是P.patens的纤维素合酶基因超家族，特别是纤维素合酶样DS（CSLD）基因家族。使用RNA干扰（RNAi）预先形成了对CSLD基因的先前研究，以预先对整个PPCSLD基因家族的功能分析丧失。CSLD基因家族的功能丧失导致抑制质子尖端的生长，表明CSLD基因家族可能调节质子会的形成。使用CRISPR/CAS9转换预先形成了CSLD5和CSLD8基因的CSLD基因在P.patens基因基因敲除（KO）中的功能。在对SG1和SG2切割位点的夏季分析中，对两个不同变换的潜在CSLD5/8双敲除击中了，总共筛选了140个潜在突变体。 使用基于竞争的PCR（CBPCR）预筛选。 当对野生型P. patens进行预知时，CBPCR引物会导致向前内引物产物（约564bps）与向前的外部引物产品（约840bps）的前进，从而可以通过在琼脂糖上运行CBPCR产品来筛选突变体，并通过降低了最终的PCR量，将CBPCR筛选为摩洛群的碱基量，并确定了降级量的降低量。 的80个潜在PPCSLD5/8 T2 KO样品筛选为16/80具有缺失基因型，因此可能是突变体，而其他64个具有WT基因型或没有扩增。，总共筛选了140个潜在突变体。使用基于竞争的PCR（CBPCR）预筛选。当对野生型P. patens进行预知时，CBPCR引物会导致向前内引物产物（约564bps）与向前的外部引物产品（约840bps）的前进，从而可以通过在琼脂糖上运行CBPCR产品来筛选突变体，并通过降低了最终的PCR量，将CBPCR筛选为摩洛群的碱基量，并确定了降级量的降低量。的80个潜在PPCSLD5/8 T2 KO样品筛选为16/80具有缺失基因型，因此可能是突变体，而其他64个具有WT基因型或没有扩增。的60 t1 ppcsld5/8 ko突变体被筛选为5/60具有缺失基因型，而55/60则是WT或无法放大的。
一种快速对基因进行 GFP 标记并富集编辑细胞的方法
图 1. 供体 DNA 模板设计。TrueTag 供体 DNA 试剂盒提供用于 (A) N 端标记或 (B) C 端标记目标基因的 PCR 模板。具有短同源臂 (HA) 序列的位点特异性引物用于 PCR 扩增以生成供体 DNA 分子。通过 CRISPR-Cas9 或 TALEN ™ 系统切割目标位点后，供体 DNA 在 HDR 过程中整合到基因组中。2A 自切割肽 (2A) 允许选择标记 (嘌呤霉素或杀稻瘟素) 和标记基因从内源启动子表达。每个模板的通用引发序列 (Uni) 允许轻松设计 PCR 引物。
补充图1
补充图 1 | ERD7 转基因拟南芥突变株系的生成和表征。（A）根据 TAIR 提供的信息，描绘了拟南芥 ERD7 ORF (AT2G17840.1) 的插图，左侧为 5' 端。标示了 ERD7 基因外显子（框）和内含子（线）以及在相应的单拷贝、T 3 纯合 erd7-1 和 erd7-2 突变株系中针对 CRISPR/Cas9 基因组编辑的 T-DNA 插入和 sgRNA 区域的相对位置。还显示了 (C) 中用于基因分型和 RT-PCR 分析的引物对的相对位置。 (B) 野生型和 erd7-2 突变株系中 ERD7 基因和蛋白质的核苷酸和推导多肽序列的比较，表明 ERD7 基因（和相应的转录本）中预期有 1711 个核苷酸缺失，导致 erd7-2 突变株系中编码蛋白质有 398 个氨基酸缺失。ERD7 野生型和 erd7-2 突变体 DNA 序列中 CRISPR/Cas9 原间隔区相邻基序带下划线。使用 ClustalO 算法 (ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo) (Madeira et al., 2019) 对野生型和突变型 ERD7 蛋白质的推导氨基酸序列进行比对。(C) erd7-1 和 erd7-2 突变株系的 PCR 和 RT-PCR 分析。图中显示的是从 15 天大的 WT、erd7-1 和 erd7-2 植物的莲座叶中提取的 gDNA 的 PCR 分析（上图）和 mRNA 的 RT-PCR 分析（下图），并使用所示引物对进行评估；引物对的位置参见 (A)。有关用于生成和表征两个 erd7 突变系的所有引物序列，另请参阅补充表 1。通过 DNA 凝胶电泳和溴化乙锭染色分析 PCR 产物和 RT-PCR 产物。注意，在两个突变系中均不存在分别对应于 ERD7 基因和 ERD7 表达（即转录本）的 PCR 和 RT-PCR 产物，而 erd7-1 突变体中存在 T-DNA，这与预期一致。拟南芥 TUB4 用作内源对照。
mytaqtm DNA聚合酶
重要的考虑因素和PCR优化，最佳条件将从反应到反应，并取决于所使用的模板/引物。5x mytaq反应缓冲液：5x MyTAQ反应缓冲液包括5mm DNTP，15mm MGCL 2，稳定器和增强剂。每个组件的浓度已得到广泛优化，从而减少了进一步优化的需求。其他PCR增强剂，例如HISPEC，Polymate或Betaine等。。引物：正向和反向引物通常以0.2-0.6M的最终浓度使用。我们建议使用0.4M作为最终浓度（即每50 le反应体积的每个引物的下午20点）。 过高的底漆浓度可以降低启动的特异性，从而导致非特异性产物。 设计底漆时，我们建议使用Primer-Design软件，例如Primer3（http://frodo.wi.mit.edu/primer3）或可单位的10mm和3mm和3mm的阳离子阳离子浓度，或者单位阳离子浓度和分别为10mm和3mm。 引物应具有约60°C模板的熔化温度（TM）：反应中的模板量主要取决于所使用的DNA类型。 对于低结构复杂性（例如质粒DNA）的模板，我们建议使用50pg-10ng DNA每50°L反应体积。 对于真核基因组DNA，我们建议每50 l反应的起始量为200ng DNA，这可以在5ng-5ng-500ng之间变化。 避免在含EDTA的解决方案中重新悬浮模板（例如）很重要 te buffer）由于EDTA螯合免费Mg 2+。每50 le反应体积的每个引物的下午20点）。过高的底漆浓度可以降低启动的特异性，从而导致非特异性产物。设计底漆时，我们建议使用Primer-Design软件，例如Primer3（http://frodo.wi.mit.edu/primer3）或可单位的10mm和3mm和3mm的阳离子阳离子浓度，或者单位阳离子浓度和分别为10mm和3mm。引物应具有约60°C模板的熔化温度（TM）：反应中的模板量主要取决于所使用的DNA类型。对于低结构复杂性（例如质粒DNA）的模板，我们建议使用50pg-10ng DNA每50°L反应体积。对于真核基因组DNA，我们建议每50 l反应的起始量为200ng DNA，这可以在5ng-5ng-500ng之间变化。避免在含EDTA的解决方案中重新悬浮模板（例如te buffer）由于EDTA螯合免费Mg 2+。初始变性：对于非复合模板，例如质粒DNA或cDNA，建议在95°C下1分钟的初始变性步骤。对于更复杂的模板，例如真核基因组DNA，为了促进DNA的完全融化，需要更长的初始变性时间至3分钟。变性：我们的协议建议在95°C下进行15S循环变性步骤，这也适用于富含GC的模板，但是对于低GC含量（40-45％）模板，可以将变性时间降低到5s。退火温度和时间：最佳退火温度取决于底漆序列，通常比对下的TM低2-5°C。我们建议运行温度梯度以确定最佳退火温度，另外55°C可以用作起点。取决于反应，退火时间也可以减少到5s。
扩增 DNA 用于遗传学研究 - PCR
聚合酶链式反应 (PCR) 技术的应用彻底改变了遗传学领域，使各种遗传学研究的 DNA 片段能够得到有效扩增。本章深入探讨了 PCR 在遗传学研究中的关键作用，阐明了其基本原理、技术和各种应用。本章首先全面介绍了 PCR 在遗传学研究中的重要性。它强调了 DNA 扩增在解开基因组秘密方面不可或缺的性质，使研究人员能够分析遗传变异、突变和遗传因素。历史概述追溯了 PCR 的演变，从它作为一种突破性技术的诞生到它在现代遗传学中的广泛应用。系统地解释了 PCR 反应的核心成分，包括 DNA 模板、引物、DNA 聚合酶和核苷酸，展示了驱动 DNA 扩增的复杂分子相互作用。扩增过程本身分为三个基本步骤：变性、引物退火和延伸。清晰的解释阐明了每个步骤的重要性以及成功扩增 DNA 所需的精确条件。本章深入探讨了引物设计的关键方面，强调了特异性和效率的必要性，以确保获得准确可靠的结果。此外，它还探讨了选择合适的 DNA 聚合酶，考虑了保真度、持续性和对抑制剂的抗性等因素。本章阐述了 PCR 在遗传学中的多功能性，概述了一系列应用。它阐述了 PCR 在遗传诊断中的应用，
16S rRNA Gen Gen分析塑料破坏细菌，印度尼西亚南部苏门答腊
抽象河流是塑料进入海洋的主要途径，包括穆西河河口。能够通过聚合酶酶降解塑料废物的细菌特征。这项研究的目的是确定细菌分离株降解塑料并确定降解塑料废物的细菌的能力。这项研究使用塑料瓶，尼龙网和小吃包装器作为降解测量的对象。使用通用PCR引物对16S rRNA基因进行鉴定，以向前引物63F（5'-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3'）和反向引物1387R（5'-GGGG cgg cgg cgg cgg cgg cgg wgt gta gta caa ggcc-3'）的形式进行细菌的鉴定分析。是20天内降解百分比最高的细菌类型，总计7.75％，是阿米洛里克法氏芽孢杆菌。使用16S rRNA基因分析对塑料降解细菌的类型鉴定显示了11种细菌，其中包括8种类型，包括HOMINIS葡萄球菌，铜绿假单胞菌，Acinetobacter sp。，acinetobactoctocter sp。，acinetobactobacter baumannii，baumannii，baumannii，acinetabacter abilis sp sp sp sp。淀粉法。细菌塑料降解的百分比相对较小，因此最好寻找可能有细菌生长的时间。