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一种测量小儿种群中线粒体DNA拷贝数的方法
保留所有权利。未经许可就不允许重复使用。（未经同行评审证明）是作者/资助者，他已授予Medrxiv的许可证，以永久显示预印本。此预印本版的版权持有人于2024年3月21日发布。 https://doi.org/10.1101/2024.03.19.24304372 doi：medrxiv preprint
有效形成单拷贝人造染色体
大型DNA组装方法是合成原核生物和发芽酵母染色体的里程碑成就的基础。通过〜125碱基对DNA序列定义的中心粒，哺乳动物和许多其他真核生物使用大型表观遗传性centromeres时，通过〜125碱基对dna序列定义的centromeres的染色体遗传。 利用中心粒表观遗传学允许人造染色体（HAC）形成，但不足以避免在引入细胞时初始DNA分子的多个多层次化。 我们描述了一种有效形成单拷贝HACS的方法。 它采用了一个〜750 kilobase的构建体，该构建体足够大，可以容纳存在于内部和外侧丝粒处的不同染色质类型，从而避免了对多聚体的需求。 通过使用酵母球体融合来简化向哺乳动物细胞的递送。 这些发展允许在后生细胞的背景下忠实的染色体工程。 y通过〜125碱基对dna序列定义的centromeres的染色体遗传。利用中心粒表观遗传学允许人造染色体（HAC）形成，但不足以避免在引入细胞时初始DNA分子的多个多层次化。我们描述了一种有效形成单拷贝HACS的方法。它采用了一个〜750 kilobase的构建体，该构建体足够大，可以容纳存在于内部和外侧丝粒处的不同染色质类型，从而避免了对多聚体的需求。通过使用酵母球体融合来简化向哺乳动物细胞的递送。这些发展允许在后生细胞的背景下忠实的染色体工程。y
实时定量PCR和两个数字PCR平台的比较，以检测FCGR3B中的拷贝数变化
结构性遗传变异（例如拷贝数变异（CNV））在调节人类疾病中的重要性越来越多。几种临床状况需要研究人类嗜中性粒细胞抗原（HNA-1），该抗原（HNA-1）由FC伽马受体IIIB基因（FCGR3B）编码，包括怀疑中性粒细胞减少，感染和主动测试血液成分供体以降低转移融合的潜在风险。在这项研究中，我们将实时定量聚合酶链反应（QPCR）与两个数字PCR（DPCR）平台，即液滴数字PCR和一个基于阵列的平台进行了比较，以确定FCGR3B中的拷贝数（CNS）。我们最初使用Quant Studio 12 Flex上的市售Taqman探针测定（Applied Biosystems）对400个匿名献血者进行了QPCR测试。确定了所有400个经过CNS范围从零到四个的测试个体的CNS。在0.2％（1/400）中检测到零副本，在3.8％（15/400）中检测到一份副本，在87.8％（351/400）中检测到两份副本，在8.0％（32/400）中检测到三本副本，在测试中的0.2％（1/400）中检测到4份（32/400）。从这个队列中，我们选择了32个从零到4的捐赠者，用于使用阵列（LOAA）在Optolane Technologies Inc.和Bio-Rad Labo Ratories的Droplean Technologies Inc.和Droplean Digital PCR（DDPCR）平台上使用阵列（LOAA）上的数字实时PCR（DPCR）进行分析。我们比较了三个平台上获得的FCGR3B的CNS，并发现了获得的中枢神经系统之间的完全一致性。因此，我们得出的结论是，所有三个平台都可以用于定量FCGR3B的CNS，尽管DPCR比QPCR具有一定的优势，但没有必要可靠地估算FCGR3B基因的CNS。
Zhang，J.，Yang，X.，Sagar，S.，Dube，T.，Koo，D.D.，Kim，B.-G.，Jung，Y.-G。，＆Zhang，J。（2022）。热粒子流体动力学模型 Chen，C。X.，Carpenter，J。S.，Murphy，T.，Brooks，P。 将在Springerlink中可视化的本章的元数据 Hopf，F。W.（2020）。关于促进成瘾相关行为的Orexin/dybocretin促进的最新观点。神经药理学，168，108013。https：//doi.org 规定的阿片类药物剂量与汽车撞车风险之间的关联 PVA-GO复合水凝胶的制备和离子的作用 SCI：贝叶斯自适应阶段I/II剂量调查设计会计，用于免疫疗法试验的半竞争风险结果 工程MWCNT/环氧纳米纤维支架的静电纺丝，以增强CFRPS的物理和机械性能 基因工程食品菜籽油 为... ccep ted rticle -iu印第安纳波利斯学者 COVID-19和未来新出现的病毒对造血细胞移植和其他细胞疗法的影响 稀释的三重和双抗生素糊的作用对牙髓干细胞并确定 TPQCI：一种基于拓扑的潜在方法，用于量化拷贝数变化的功能影响 双重因果效应的强大估计 Niculescu，A。B.和Le-Niculescu，H。（2020）。最近的GWAS数据与以前的血液生物标志物的收敛：独立reproducibili
Zhang，J.，Yang，X.，Sagar，S.，Dube，T.，Koo，D.D.，Kim，B.-G.，Jung，Y.-G。，＆Zhang，＆Zhang，J. （2022）。 使用磨料水喷射技术对热屏障涂层过程的平滑颗粒流体动力学建模。 制造科学与工程杂志，144（091012）。 https://doi.org/10.1115/1.4055048Zhang，J.，Yang，X.，Sagar，S.，Dube，T.，Koo，D.D.，Kim，B.-G.，Jung，Y.-G。，＆Zhang，＆Zhang，J.（2022）。使用磨料水喷射技术对热屏障涂层过程的平滑颗粒流体动力学建模。制造科学与工程杂志，144（091012）。https://doi.org/10.1115/1.4055048
相对于不同组织之间的核DNA量的线粒体DNA拷贝数差异
线粒体DNA是研究和诊断领域的广泛测试的遗传标记。尽管如此，对不同组织中其丰度和质量的了解仍然很少。为了获得有关mtDNA含量和质量的更深入的知识，我们研究了九个组织，包括血液，骨骼，脑，头发（根和轴），心肌，肝脏，肺，肺，骨骼肌，骨骼肌和颊粘膜，以及使用两个实时定量PCR的个体使用，具有不同的基于PCR的个体，具有不同的MTDNA和NDNA和NDNA的ndnna和NDNDNA。结果表明，nDNA的数量是估计个体组织中mtDNA量以及跨个体组织的较弱的替代物。尤其是头发显示出极大的变化，描绘了每个头发碎片的多个mtDNA分子的范围。此外，降解可能会导致PCR可用的片段更少。结果要求在下游基因分型测定之前平行确定mtDNA的数量和质量。
线粒体DNA氧化，甲基化和双极抑郁症的拷贝数改变
情绪障碍，包括重度抑郁症（MDD）和双相情感障碍（BD），是普遍且致残的精神疾病（1）。情绪障碍的患者表现出由遗传和环境因素的复杂相互作用引起的症状（2-4）。尽管有很多发现，涉及各个级别的结构和功能改变，从微结构和分子途径到神经网络，但对抑郁症基本机制的理解仍然很少（4）。最近的证据表明，情绪障碍与几种机制有关，包括表观遗传调节和氧化应激，这可以触发基因组材料中的各种修饰，例如DNA甲基化或氧化（3，5，6）。表观遗传调节包括控制基因表达的机制，而DNA核苷酸序列没有任何变化。越来越多的报告表明表观遗传机制，例如DNA甲基化，组蛋白修饰和非编码RNA可能在情绪障碍的发病机理以及对药理干预措施的反应中起关键作用（3、5、7、8）。在表观遗传机理中，DNA甲基化是情绪障碍中最广泛的研究，涉及将甲基添加到DNA分子中。DNA甲基化改变经常在抑郁症患者中显示（9）。除了甲基化变化外，DNA还易于自由基氧化，从而导致氧化引起的DNA损伤。以前的证据支持氧化诱导的DNA损伤在抑郁症的发病机理中存在（10 - 13）。但是，这些发现仅基于核遗传物质在内的核DNA和RNA的修改。线粒体是半自治的细胞器，其中包含其自己的，圆形的，母体遗传和双链（即重和轻链）线粒体DNA（mtDNA），并用作人体的主要能量供应。mtDNA编码属于电子传输链复合物，22个转移RNA和2个核糖体RNA的13个多肽，并包含一个非编码区域，其中包括位移环（D-Loop）（14，15）。mtDNA的改变可能会导致线粒体基因表达的变化，从而影响人体的线粒体功能和生物能调节，从而导致线粒体功能障碍（16）。线粒体功能障碍已被确定为抑郁症各个方面的关键机制之一，例如精神症状和神经认知异常以及早期衰老（17，18）。先前的研究报告了MDD和BD（19，20）中线粒体代谢产物，基因或蛋白质水平的异常，并提出了类似的线粒体功能障碍，这些疾病之间的线粒体功能障碍（21 - 23）。尽管mtDNA比核DNA更容易受到基因组修饰的影响（例如甲基化和氧化）（24，25），但识别mtDNA修饰，
不同葡萄品种的年轻和成熟叶片中线粒体和叶绿体DNA的相对拷贝数
摘要。亚细胞细胞器（植物）的DNA矩阵的拷贝数可以作为光合作用和氧化磷酸化过程的强度的指标。我们评估了三种葡萄品种的年轻和成熟叶子中线粒体和叶绿体DNA的相对拷贝数（RCN）：“ Traminer Pink”，“ Chardonnay”和“ Syrah”和“ Syrah”，在田间条件下生长。叶样品（5-10 mg），以进行随后的总DNA提取。使用LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix（Lifescience，Roche）和LightCycler 96自动分析仪（Roche Life Science）进行QRT-PCR反应。使用GAPDH基因（染色体DNA）确定NAD1基因（线粒体DNA）和RPS16基因（叶绿体DNA）的相对拷贝数。使用2 -∆ CT 2- ∆ΔCT算法进行定量评估。已经确定，叶绿体和线粒体DNA的相对拷贝数（RCN）值变化，并取决于葡萄的品种和叶片成熟度。RCN在成熟的葡萄叶中的光合作用强度和成熟葡萄叶片的氧化磷酸化强度更高。在评估宏观能力平衡（MEB）指标时，可以得出结论，通过光合作用过程在叶绿体中获得的能量的2％至4％用于生产年轻叶子和成熟叶片中各种葡萄品种的线粒体中的宏观能。我们开发的实验方案可以成功用作测试系统，以评估各种葡萄品种的潜在产量。
精神分裂症同卵双胞胎的线粒体 DNA 拷贝数和异质体不一致
精神分裂症 (SZ) 是一种严重、复杂且常见的精神疾病，具有高遗传性 (80%)、成人发病年龄和同卵双胞胎 (MZ) 中的高度不一致 (∼ 50%)。对家族性和非家族性病例的大量研究表明 SZ 中存在许多分离突变和从头改变，其中可能包括线粒体基因组的改变。然而，尚未发现单一的普遍致病变异，突显了其广泛的遗传异质性。本报告特别关注使用血液对一组独特的同卵双胞胎不一致 (MZD) 中 SZ 的线粒体基因组变化进行评估。将六对 MZD 双胞胎和两组父母 (N = 16) 的基因组 DNA 与 Affymetrix Human SNP Array 6.0 杂交，以评估线粒体 DNA 拷贝数 (mtDNA-CN)。对 MZD 对及其父母的子集进行了全基因组测序 (WGS) 和定量聚合酶链式反应 (qPCR)，并用于得出 mtDNA-CN 估计值。进一步分析了 WGS 数据以生成异质体 (HP) 估计值。我们的结果表明，正如预期的那样，配对内和母子差异的 mtDNA-CN 估计值小于涉及无关个体的比较。MZD 双胞胎的 mtDNA-CN 估计值不一致，并且在所有技术中 mtDNA-CN 差异的方向性一致。此外，qPCR 在基于相关性估计 mtDNA-CN 方面表现优于 Affymetrix。在 MZD 双胞胎之间未检测到可靠的 HP 差异。观察到的 MZD 内 mtDNA-CN 差异代表合子后体细胞变化，可能导致 MZ 双胞胎在疾病（包括 SZ）方面不一致。
基于 CRISPR/Cas9 的多拷贝整合系统用于黑曲霉中的蛋白质生产
丝状真菌黑曲霉因其高蛋白质分泌能力而闻名，是同源和异源蛋白质生产的首选宿主。为了进一步提高黑曲霉的蛋白质生产能力，我们制备了一组专用的蛋白质生产菌株，其在基因组的预定位置包含多达 10 个葡糖淀粉酶着陆位点 (GLS)。这些 GLS 取代了编码大量存在或编码不需要的功能的酶的基因。每个 GLS 都包含葡糖淀粉酶基因 (glaA) 的启动子和终止子区域，该基因是黑曲霉中表达最高的基因之一。整合多个基因拷贝（通常通过随机整合实现）可提高蛋白质产量。在我们的方法中，GLS 允许使用 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑快速进行靶向基因替换。通过在每个 GLS 中引入相同或不同的独特 DNA 序列（称为 KORE 序列）并设计 Cas9 兼容的单向导 RNA，人们能够选择目标基因在哪个 GLS 整合。通过这种方式，可以轻松快速地制备一组具有不同目的基因拷贝数的相同菌株，以比较蛋白质生产水平。为了说明其潜力，我们成功地利用表达平台生成多拷贝 A. niger 菌株，该菌株产生 Penicillium expansum PatE::6xHis 蛋白，催化棒曲霉素生物合成的最后一步。表达 10 个拷贝 patE::6xHis 表达盒的 A. niger 菌株在培养基中产生约 70 lg mL 1 PatE 蛋白，纯度略低于 90%。
亚克隆体细胞拷贝数变异在复发性骨肉瘤中出现并占主导地位 Michael D. Kinnaman 1,2 , Simone Zaccaria 3,4 , Alvin Makohon-
摘要 ◥ 人们在骨肉瘤中进行了多项大规模基因组分析，以确定肿瘤发生、治疗反应和疾病复发的基因组驱动因素。肿瘤内空间和时间的异质性也可能在促进肿瘤生长和治疗耐药性方面发挥作用。我们对 8 名复发或难治性骨肉瘤患者的 37 个肿瘤样本进行了纵向全基因组测序。每位患者至少有一个来自原发部位和转移或复发部位的样本。除一名患者外，所有患者均发现了亚克隆拷贝数变异。在 5 名患者中，来自原发性肿瘤的亚克隆出现并在随后的复发中占主导地位。在 7 名具有多个克隆的患者中，6 名患者的治疗耐药性克隆中 MYC 增益/扩增富集。在耐药拷贝数克隆中还观察到了其他潜在驱动基因（如 CCNE1 、 RAD21 、 VEGFA 和 IGF1R ）的扩增。染色体重复时间分析显示，复杂的基因组重排通常发生在诊断之前，支持宏观进化的进化模型，其中大量基因组畸变在短时间内获得，然后进行克隆选择，而不是持续进化。复发性肿瘤的突变特征分析表明，同源修复缺陷 (HRD) 相关的 SBS3 在每个