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CRISPR 敲入方案
注意：确保将 Cas9 蛋白作为反应中的最后一种材料添加。在 KO 实验中，无需添加 HDRT。表中 Cas9 与 sgRNA 的比例为 1:3，对于 1.8kb ssDNA，HDRT 为 4 μ g。强烈建议针对每个具体设计对 Cas9：sgRNA 比例以及 Cas9 蛋白和 HDRT 的量进行实验优化。GenScript 建议通过测试 1:1 和 1:4 之间的 RNP 比例开始优化。我们建议 ssDNA 的量可以设置在 2 μ g 和 6 μ g 之间（对于 0.5kb 和 4kb 之间的 HDRT 长度；如果 HDRT 长度超出此范围，则可能需要适当调整试剂的量）。最好为第一次实验分别设置阴性对照、阳性对照和转染对照。
基于质粒的CRISPR敲入秀丽隐杆线虫
图1。基于质粒的CRISPR敲入的高度提高的克隆效率：（a）泳道1：NEB®DNA梯子标准（N3200S）；泳道2：标准NEB®Q5PCR方案30个周期的Q5 PCR方案基于光涂抹和〜300bp的额外不需要的PCR产物导致过多的DNA，可重复出现30个周期。车道3-8：优化PDD162扩增的PCR循环编号。基于此数据，我们选择了15个周期作为PDD162所有后续扩增的最佳数字。（b）过多的PCR产物和DPNI消化不足会导致约35％的KLD连接克隆是错误的CAS9/SGRNA质粒。相反，优化PCR和KLD连接反应会导致90％的克隆具有正确的GRNA插入。（c）载体主链和用于
酪氨酸羟化酶 TH-Cre 敲入大鼠
该模型在内源性酪氨酸羟化酶 (TH) 启动子的控制下表达 cre-重组酶，从而能够在多巴胺能神经元中进行特异性表达。该模型在 TH 开放阅读框的翻译终止后立即有 (IRES)-cre 的定向插入。TH-Cre 大鼠可用于需要组织特异性表达的应用，包括光遗传学和转基因 floxed 系育种。
当前提高 CRISPR 敲入效率的策略
摘要：自 2012 年发现以来，成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 和 CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9) 系统为开发新型、高精度的基于基因组编辑的基因治疗 (GT) 替代方案提供了广阔的前景，从而克服了与经典 GT 相关的挑战。经典 GT 旨在通过慢病毒 (LV) 或腺相关病毒 (AAV) 将转基因随机整合到基因组中或以游离形式持续进入细胞核，从而将转基因递送到细胞中。尽管使用 LV 或 AAV 可以实现高转基因表达效率，但它们的性质可能会对人类产生严重的副作用。例如，基于 LV（NCT03852498）和 AAV9（NCT05514249）的 GT 临床试验分别表明，用于治疗 X 连锁肾上腺脑白质营养不良症和杜氏肌营养不良症的 GT 出现了骨髓增生异常综合征和患者死亡。与经典 GT 相比，基于 CRISPR/Cas9 的基因组编辑需要细胞的同源直接修复 (HDR) 机制才能将转基因插入基因组的特定区域。这种复杂且受良好调控的过程在哺乳动物细胞的细胞周期中受到限制，而非同源末端连接 (NHEJ) 则占主导地位。因此，寻找提高 HDR 效率的方法，使其优于 NHEJ，至关重要。本文全面回顾了当前用于改进基于 CRISPR/Cas9 的 GT 的 HDR 的替代方案。
入札 入力（24S1E9026～9029）
另外，收件人应为“国防部联合参谋部总务部总务科会计室合同处”。 2 邮寄需发送的文件 （1）国防部招标资格审查结果通知书（各省厅统一资格审查） （2）投标文件 3 信封 装入上述（2）项的信封（以下称“内信封”）约为长3mm（长235mm×宽1,230mm），正面用黑色或红色写明“内附投标文件”字样。 将写明上述（1）项的信封装入外信封中，并在外信封上也写上“附有投标文件”后寄出。 4.投标数量 仅初次投标有效，重新投标等将被视为拒绝投标。 5.投标无效除本通知第7条的规定外，以邮寄方式提交的投标如未在截止时间到达，则投标无效。
hiPSC 中的敲除/SNP 敲入方案
基因工程将细胞置于选择压力之下，需要几轮细胞倍增才能获得编辑后的克隆。因此，为避免基因组不稳定性积累，我们建议使用解冻后 2-3 次传代的细胞，尽可能接近质量测试过的细胞库。我们还建议在缺氧条件下（37 C/5% CO 2 /5% O 2 ）维护 hiPSC 并进行基因编辑实验，因为在缺氧条件下培养 hiPSC 有几个优点，包括增强多能性、增加增殖、减少氧化应激、提高重编程效率、更好的分化潜力和低遗传不稳定性频率。2、3 这些好处可以提高 hiPSC 的质量和功能，这对于再生医学和疾病建模中的下游应用至关重要。Vallone 等人描述了描述板涂层、细胞维护以及酶促和非酶促解离的一般方案。4
dsps311a敲入小鼠复制临床病理...
保留所有权利。未经许可就不允许重复使用。永久性。预印本（未经Peer Review认证）是作者/资助者，他已授予Medrxiv的许可证，以在2025年1月20日发布的此版本中显示此版本的版权所有者。 https://doi.org/10.1101/2025.01.14.24319713 doi：medrxiv preprint
CRISPR敲入协议 - 用于Jurkat细胞...
注意：确保将Cas9蛋白添加为反应中的最后材料。在KO的情况下，无需添加HDRT。表中Cas9与SGRNA的比率为1：3，对于1.8kb dsDNA，HDR为1μg。强烈建议每种特定设计对CAS9的实验优化：SGRNA比和Cas9蛋白和HDRT的量。Genscript建议通过测试1：1至1：4之间的RNP比率开始优化。我们建议最初可以将DsDNA的量设置在0.5μg和3μg之间（对于0.5kb和4KB之间的HDRT；如果HDRT长度超过此范围，则可能需要适当调整试剂的量）。为第一个实验分别设置负面对照，阳性对照和转染控制是最好的做法。
