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AAVS1 和 ROSA26 位点的 CRISPR 转基因敲入
pCas-Guide-scramble（SKU GE100003） AAVS1 供体载体（SKU GE100024、GE100035、GE100046、GE100048） 预先设计的 AAVS1 供体对照，具有不同的转基因和耐药标记组合（SKU GE100037、GE100039、GE100026、GE100063、GE100064、GE100065、GE100066、GE100068、GE100069、GE100070、GE100071、GE100072、GE100073） AAVS1 转基因敲入载体试剂盒（puro）（SKU GE100027） AAVS1 转基因敲入载体试剂盒（BSD）（SKU GE100036） AAVS1 转基因敲入载体试剂盒（EF1a-puro）（SKU GE100046） AAVS1 转基因敲入载体试剂盒（EF1a-BSD）（SKU GE100048） AAVS1 Cas9 插入载体试剂盒，Puro（SKU GE100038）和 BSD（SKU GE100040）
表征 CRISPR 敲入细胞中内源性 Claudin-1 的表达、运动性和对丙型肝炎病毒的易感性。
1 法国国家科学研究院、IRIM 蒙彼利埃传染病研究所，34293 蒙彼利埃，法国 2 蒙彼利埃大学，34090 蒙彼利埃，法国 3 INSERM U1110 – 病毒和肝病研究所 (IVH) 4 斯特拉斯堡大学，67000 斯特拉斯堡，法国 5 斯特拉斯堡大学医院、大学医院研究所肝消化道中心，67000 斯特拉斯堡，法国
作为斑马鱼 CRISPR 介导的变异敲入工具，Prime 编辑的效果优于同源定向修复
（未经同行评审认证）是作者/资助者。保留所有权利。未经许可不得重复使用。此预印本的版权所有者此版本于 2025 年 2 月 5 日发布。；https://doi.org/10.1101/2025.02.05.636566 doi：bioRxiv preprint
dsps311a敲入小鼠复制临床病理...
保留所有权利。未经许可就不允许重复使用。永久性。预印本（未经Peer Review认证）是作者/资助者，他已授予Medrxiv的许可证，以在2025年1月20日发布的此版本中显示此版本的版权所有者。 https://doi.org/10.1101/2025.01.14.24319713 doi：medrxiv preprint
基础编辑酶，用于用同时基因敲入和敲除
价值主张成功的细胞疗法的开发需要多重编辑和有效的CMC流程，但是对多个平台和连续处理步骤的需求通常会导致复杂性和成本增加。BEKI基因编辑策略通过结合敲入和敲除其他基因的插入，降低毒性和靶向效果的效果来提供解决方案（图1a）。不需要的副作用，例如染色体易位的发生，将其降低至几乎不可检测的最小值（图。1C）。这种方法可以增强安全性，最大程度地减少原代细胞的损失，降低GMP成本并简化优化和验证过程，从而使其成为细胞治疗开发的有吸引力的选择。
当前提高 CRISPR 敲入效率的策略
摘要：自 2012 年发现以来，成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 和 CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9) 系统为开发新型、高精度的基于基因组编辑的基因治疗 (GT) 替代方案提供了广阔的前景，从而克服了与经典 GT 相关的挑战。经典 GT 旨在通过慢病毒 (LV) 或腺相关病毒 (AAV) 将转基因随机整合到基因组中或以游离形式持续进入细胞核，从而将转基因递送到细胞中。尽管使用 LV 或 AAV 可以实现高转基因表达效率，但它们的性质可能会对人类产生严重的副作用。例如，基于 LV（NCT03852498）和 AAV9（NCT05514249）的 GT 临床试验分别表明，用于治疗 X 连锁肾上腺脑白质营养不良症和杜氏肌营养不良症的 GT 出现了骨髓增生异常综合征和患者死亡。与经典 GT 相比，基于 CRISPR/Cas9 的基因组编辑需要细胞的同源直接修复 (HDR) 机制才能将转基因插入基因组的特定区域。这种复杂且受良好调控的过程在哺乳动物细胞的细胞周期中受到限制，而非同源末端连接 (NHEJ) 则占主导地位。因此，寻找提高 HDR 效率的方法，使其优于 NHEJ，至关重要。本文全面回顾了当前用于改进基于 CRISPR/Cas9 的 GT 的 HDR 的替代方案。
HiHo-AID2：提高纯合敲入效率可实现人类生长素诱导的降解细胞的强劲生成
背景 生长素诱导降解 (AID) 技术可通过化学遗传学控制蛋白水解 [ 1 ]。为了应用 AID，需要通过基因工程将不稳定肽或“降解决定子”标记到目标蛋白上。生长素受体（如 Os TIR1）在相同细胞中外源表达，作为 Skp1-Cullin1-TIR1 (SCF TIR1 ) 泛素连接酶复合物的底物识别亚基发挥作用。生长素（如吲哚-3-乙酸，IAA）作为化学胶水连接 SCF TIR1 泛素连接酶和降解决定子标记蛋白，导致降解决定子标记蛋白快速多泛素化和蛋白酶体降解 [ 1 , 2 ]。 AID 能够快速高效地降解靶蛋白，避免长期沉默或 CRISPR 敲除过程中出现的副作用，并为理解动态生物过程中不同靶蛋白的功能提供了重要的机制见解 [ 3 – 7 ]。然而，一些障碍限制了我们充分发挥 AID 潜力的能力。
CRISPR 敲入协议 - 用于刺激人类 T 细胞......
注意：确保将 Cas9 蛋白作为反应中的最后一种材料添加。如果进行了敲除编辑，则无需添加 HDRT。表中 Cas9 与 sgRNA 的比例为 1:3。强烈建议对每个设计进行 Cas9：sgRNA 比例以及 Cas9 蛋白和 HDRT 的量进行实验优化。GenScript 建议通过测试 1:1 和 1:4 之间的 RNP 比例开始优化。ssDNA 或 dsDNA 的量可以分别最初设置在 1 μ g - 4 μ g 或 0.2 μ g - 1 μ g 之间（对于 0.5 kb 和 4 kb 之间的 HDRT；如果 HDRT 长度超出此范围，则需要相应调整试剂量）。最好为第一次实验设置阴性对照、阳性对照和转染对照。
使用 RNAi 在中国仓鼠卵巢细胞中同时敲入/敲除 Caspase 8 相关蛋白 2 基因的时间和成本有效的基因组编辑方案
背景：CHO 细胞是生产生物制药的首选，而基因组编辑技术为提高重组蛋白产量提供了机会。靶向凋亡相关基因，如 Caspases 8 相关蛋白 2 (CASP8AP2)，可提高 CHO 细胞的活力和生产力。将强大的策略与 CRISPR-Cas9 系统相结合使其能够应用于 CHO 细胞工程。目标：本研究旨在开发一种经济有效的方案，使用 CRISPR-Cas9 系统结合 HITI 策略同时在 CHO 细胞中缺失/插入 CASP8AP2 基因，并评估其对细胞活力和蛋白质表达的影响。材料和方法：我们通过将 CRISPR/Cas9 与 HITI 策略相结合，开发了一种有效的 CHO 细胞工程方案。使用 CHOPCHOP 软件设计了两个不同的 sgRNA 序列以靶向 CASP8AP2 基因的 3' UTR 区域。使用经济高效的 PEI 试剂将 gRNA 克隆到 PX459 和 PX460-1 载体中，并转染到 CHO 细胞中。采用手动选择系统简化单细胞克隆过程。MTT 测定评估 24、48 和 72 小时的基因沉默和细胞活力。流式细胞术评估 CASP8AP2 沉默的 CHO 细胞中的蛋白质表达。结果：研究证实了将 CRISPR-Cas9 与 HITI 策略相结合的稳健性，在产生敲除克隆方面实现了 60% 的高效率。PEI 转染成功地将构建体传递给近 65% 的克隆，其中大多数是纯合的。该方案被证明适用于资源有限的实验室，只需要倒置荧光显微镜。 CASP8AP2 敲除 (CHO-KO) 细胞经 NaBu 处理后，与 CHO-K1 细胞相比，其细胞存活率显著延长，48 小时时的 IC50 值分别为 7.28 mM 和 14.25 mM（P 值：24 小时 ≤ 0.0001，48 小时 ≤ 0.0001，P 值：72 小时 = 0.0007）。与天然细胞相比，CHO CASP8AP2 沉默细胞的 JRed 表达增加了 1.3 倍。结论：使用 CRISPR-Cas9 和 HITI 策略有效改造 CHO 细胞，同时进行 CASP8AP2 基因缺失/插入，从而提高细胞存活率和蛋白质表达。