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World File Search System敲入
将荧光蛋白基因定向敲入鸡体内
在鸡中，原始生殖细胞 (PGC) 是基因敲入等高级基因组编辑的有效靶点。尽管已经建立了鸡 PGC 的长期培养系统，但仍有必要选择一种高效、精确的基因编辑工具来编辑 PGC 基因组，同时保持其对生殖系统的贡献能力。与传统用于生成敲入鸡的同源重组方法相比，成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9) 和 CRISPR 介导的精确整合到目标染色体 (CRIS-PITCh) 方法更胜一筹，因为供体载体更易于构建、基因组编辑效率高，并且不会选择目标细胞。在本研究中，我们利用 CRIS-PITCh 方法将荧光蛋白基因盒作为融合蛋白整合到鸡 PGC 的鸡血管同源物 ( CVH ) 基因座中，从而设计了敲入鸡 PGC。敲入 PGC 在体内和体外均表达荧光蛋白，便于对 PGC 进行追踪。此外，我们还表征了设计双敲入细胞系的效率。通过有限稀释获得敲入细胞克隆，并通过基因分型确认设计双敲入细胞系的效率。我们发现 82% 的分析克隆都成功敲入了两个等位基因。我们认为，从敲入 PGC 中生产模型鸡可用于各种研究，例如阐明鸡的生殖细胞命运和性别决定。
AAVS1 和 ROSA26 位点的 CRISPR 转基因敲入
pCas-Guide-scramble（SKU GE100003） AAVS1 供体载体（SKU GE100024、GE100035、GE100046、GE100048） 预先设计的 AAVS1 供体对照，具有不同的转基因和耐药标记组合（SKU GE100037、GE100039、GE100026、GE100063、GE100064、GE100065、GE100066、GE100068、GE100069、GE100070、GE100071、GE100072、GE100073） AAVS1 转基因敲入载体试剂盒（puro）（SKU GE100027） AAVS1 转基因敲入载体试剂盒（BSD）（SKU GE100036） AAVS1 转基因敲入载体试剂盒（EF1a-puro）（SKU GE100046） AAVS1 转基因敲入载体试剂盒（EF1a-BSD）（SKU GE100048） AAVS1 Cas9 插入载体试剂盒，Puro（SKU GE100038）和 BSD（SKU GE100040）
优化的 HDR 介导的 K-荧光蛋白敲入...
图 2：在 K-562 细胞中通过电穿孔优化 HDR 介导的报告基因敲入。A. LMNA -EGFP 供体质粒单独电穿孔，浓度增加，显示非特异性 EGFP 表达量较低。Cas9 蛋白：crRNA：tracrRNA 电穿孔，LMNA -EGFP 供体质粒浓度增加，显示 EGFP 表达相关增加。B. 放大倍数增加后，HDR 介导的敲入样本中 EGFP 表达的定位与 LMNA 的预期一致，位于细胞核中，并与 Hoechst 染色共定位。C. HDR 介导的敲入细胞群的流式细胞术分析显示，随着 DNA 供体质粒数量的增加，EGFP 表达增加高达 32%。单独 DNA 供体质粒对照的相应分析显示所有剂量的 EGFP 表达均低于 0.5%（未显示数据）。
基础编辑酶，用于用同时基因敲入和敲除
价值主张成功的细胞疗法的开发需要多重编辑和有效的CMC流程，但是对多个平台和连续处理步骤的需求通常会导致复杂性和成本增加。BEKI基因编辑策略通过结合敲入和敲除其他基因的插入，降低毒性和靶向效果的效果来提供解决方案（图1a）。不需要的副作用，例如染色体易位的发生，将其降低至几乎不可检测的最小值（图。1C）。这种方法可以增强安全性，最大程度地减少原代细胞的损失，降低GMP成本并简化优化和验证过程，从而使其成为细胞治疗开发的有吸引力的选择。