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World File Search System敲除
基因敲除试剂盒 v2 - NET
图 1. 多引导 sgRNA 可实现高敲除效率。为三个基因（ ALPK3 、 JAK1 、 NUAK2 ）设计了三个单引导 RNA，并分别引入（sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3）和一起引入（多引导）。平均而言，多引导 sgRNA 的表现分别比 ALPK3 、 JAK1 和 NUAK2 的单个引导 RNA 好 50.8%、32.1% 和 48.2%。通过核转染将核糖核蛋白 (RNP) 转染到 HEK293 细胞（针对 ALPK3 ）和 MCF7 细胞（针对 JAK1 和 NUAK2 ）。对每个靶标周围的区域进行 PCR 扩增、桑格测序，并使用 CRISPR 编辑推断 (ICE) 分析进行分析。敲除 (KO) 分数是指导致推定敲除（移码诱导插入/缺失和 21+ bp 片段缺失）的序列百分比。
和 keap1b 基因敲除斑马鱼
Keap1 – Nrf2 通路是一种进化保守的机制，可保护细胞免受氧化应激和亲电试剂的侵害。在稳态条件下，Keap1 与 Nrf2 相互作用并导致其快速蛋白酶体降解，但当细胞暴露于氧化应激/亲电试剂时，Keap1 会感知它们，导致 Keap1 – Nrf2 相互作用不当和 Nrf2 稳定。因此，Keap1 被认为是 Nrf2 激活的“抑制剂”和“应激传感器”。有趣的是，鱼类和两栖动物有两种 Keap1（Keap1a 和 Keap1b），而哺乳动物、鸟类和爬行动物只有一种。系统发育分析表明，哺乳动物 Keap1 是鱼类 Keap1b 的直系同源物，而不是 Keap1a。在本研究中，我们使用斑马鱼遗传学研究了 Keap1a 和 Keap1b 之间的差异和相似之处。我们构建了 keap1a 和 keap1b 的斑马鱼基因敲除系。两种基因敲除系的纯合突变体均可存活且可育。在两种突变幼虫中，Nrf2 靶基因的基础表达和抗氧化活性均以 Nrf2 依赖的方式上调，表明 Keap1a 和 Keap1b 均可作为 Nrf2 抑制剂发挥作用。我们还分析了 Nrf2 激活剂萝卜硫素对这些突变体的影响，发现 keap1a- ，而非 keap1b- ，基因敲除幼虫对萝卜硫素有反应，表明两种 Keap1 的压力/化学感应能力不同。
IN4MER CRISPR/Cas12a 多重敲除平台
高效基因敲除和遗传相互作用：IN4MER CRISPR/Cas12a 多重敲除平台 Nazanin Esmaeili Anvar 1,2,* , Chenchu Lin 1,* , Xingdi Ma 1,2,* , Lori L. Wilson 1 , Ryan Steger 3 , Annabel K. Sangree 3 , Medina Colic 1 , Sidney H. Wang 4 , John G. Doench 3 , Traver Hart 1,5,6
RNA 引导的 AsCas12a 和 SpCas9 催化敲除...
寡核苷酸和基于序列的试剂 PCR 引物 本研究 从 IDT ssODN 合成 Ittiprasert 等人，2019 年和本研究 Ultramer DNA Oligos， 从 IDT 合成向导 RNA Ittiprasert 等人，2019 年和本研究 从 IDT 合成 化学品、酶和其他试剂 Alt-R® CRISPR-Sp HiFi Cas9 酶 V3 Integrated DNA Technologies 1081060 Alt-R® CRISPR-AsCas12a 酶 V3 Integrated DNA Technologies 1081068 DNAzol® ES 试剂 Molecular Research Center DN127 RNAzol® RT 试剂 Molecular Research Center RN190 Opti-MEM FisherScientific Gibco™ 31985062 DMEM FisherScientific 88364 胎牛血清 FisherScientific Gibco™ 26140079 100x 青霉素-链霉素-两性霉素 B FisherScientific SV30079.01 NucleoSpin® 凝胶和 PCR 纯化 Takara 740609
总共敲除单纯疱疹病毒型基因...
抽象简介。单纯疱疹病毒1型（HSV-1）是一种导致严重人类疾病并建立长期潜在感染的病毒。该病毒的潜在形式已证明对抗病毒药物有抗性。群集定期间空间短质体重复序列（CRISPR）是基因组工程中的重要工具，由指导RNA（GRNA）和Cas9核酸酶组成，它使RNA蛋白质复合物使RNA蛋白复合物可以消化GRNA的独家目标序列实现。此外，CRISPR-CAS9系统通过敲除某些病毒基因的敲除有效抑制了HSV-1感染。材料和方法。为了调查CAS9系统对HSV-1基因组破坏的功效，我们设计了所有包装在一个载体中的指南RNA（GRNA）。此外，我们使用BAMHI和ESP3I酶进行了一步限制。结果。CRISPR/CAS9系统被转染到HEK-AD细胞中，该细胞显示通过斑块测定和实时PCR对HSV-1感染显着降低。结论。PCAS指南-EF1A-GFP CRISPR载体可以通过限制酶（ESP3I（BSMBI）和BAMHI）创建一种快速有效的GRNA克隆方法。因此，CRISPR/CAS9系统可用于筛选对HSV-1感染至关重要的基因，并为HSV-1引起的病毒感染的靶向治疗制定新的策略。（Folia Histochemica et cytobiologica 2020，vol。58，编号3，174–181）
CRISPR/Cas9 介导的 EZH2 敲除抑制了……
摘要：三阴性乳腺癌（TNBC）是一种侵袭性极强的乳腺癌亚型，具有肿瘤内异质性的特点，与其他类型的乳腺癌相比，TNBC更易发生侵袭和转移。本研究旨在探讨腺病毒介导的成簇调控间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9系统是否能够有效靶向TNBC细胞中的zeste增强子同源物2（EZH2），为CRISPR/Cas9系统用于乳腺癌的基因治疗奠定实验基础。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑工具在MDA-MB-231细胞中敲除EZH2，建立EZH2敲除（KO）组（EZH2-KO组），另设GFP敲除组（对照组）和空白组（Blank组）。通过T7 内切酶I（T7EI）酶切、mRNA检测及Western印迹实验验证载体构建及EZH2-KO成功。通过MTT、划痕实验、Transwell及体内肿瘤生物学实验检测基因编辑后MDA‑MB‑231细胞增殖及迁移能力的变化。mRNA及蛋白检测结果显示，EZH2‑KO组EZH2的mRNA及蛋白表达均明显下调。EZH2 mRNA及蛋白表达的差异在EZH2‑KO组中有所体现。
使用 CRISPR/... 生成 OsPUB7 敲除突变体
摘要：植物在遭受非生物胁迫时会产生和积累抗逆物质，这涉及一种蛋白质转化机制，即分解逆境损伤的蛋白质并提供可用的氨基酸。真核生物的蛋白质周转主要由泛素化途径驱动。在蛋白质降解所需的三种酶中，E3泛素连接酶在大多数细胞中起着关键作用，因为它决定了泛素化的特异性并选择要降解的靶蛋白。在本研究中，为了研究OsPUB7（水稻的植物U-box基因）的功能，我们构建了CRISPR/Cas9载体，生成OsPUB7基因编辑个体，并使用基因编辑株系评估对非生物胁迫的抗性。在缺乏T-DNA的T 2 OsPUB7基因编辑无效株系（PUB7-GE）中观察到干旱和盐分胁迫处理的抗逆表型。此外，尽管 PUB7-GE 在 mRNA 表达分析中没有显示出任何显著变化，但它显示出比野生型 (WT) 更低的离子泄漏和更高的脯氨酸含量。蛋白质-蛋白质相互作用分析表明，已知与胁迫有关的基因 (OsPUB23、OsPUB24、OsPUB66 和 OsPUB67) 的表达在 PUB7-GE 中增加，并通过与 OsPUB66 和 OsPUB7 形成 1 节点网络，充当干旱和盐胁迫的负调节剂。这一结果证明 OsPUB7 将成为水稻育种和未来抗旱/非生物胁迫研究的有用目标。
HLA-A/B/C敲除电穿孔套件
说明HLA-A/B/C敲除电穿孔套件适用于通过电穿孔的细胞系和原代T细胞工程。该套件既包含Cas9酶（链球菌）和靶向HLA-A/B/C（人白细胞抗原）的GRNA。该套件足以设计高达500万个原代T细胞。背景HLA（人白细胞抗原）-a，b和c是MHC的三种主要类型（主要的组织相容性复合物）1类跨膜蛋白。它们与β2微球蛋白蛋白（由B2M基因编码）形成异二聚体。MHC 1类分子表现出短多肽，通常在长7-11个氨基酸之间，以识别为“自我”或“非自身”的免疫系统。HLA-C存在于所有细胞中，并且由于HLA-C基因的多样性而作为几种单倍型存在。c*08：02代表一种这样的单倍型。HLA I类将新抗原衍生的肽呈现到细胞表面，从而通过TCR（T细胞受体）识别出T细胞的识别。 癌症免疫疗法一直在使用该机制，方法是表达能够识别特定癌症免疫原子的TCR。 在2016年，HLA-C*08：02限制性TIL（肿瘤浸润淋巴细胞）在肺癌中靶向KRAS（Kirsten大鼠肉瘤病毒）G12D突变，导致阳性结果。 在转移性胰腺癌患者中采用了类似的方法，并导致该疾病的消退。 HLA-C*08：02限制性TIL对其他新抗原的TCR的研究可能对癌症治疗有益。 应用程序HLA I类将新抗原衍生的肽呈现到细胞表面，从而通过TCR（T细胞受体）识别出T细胞的识别。癌症免疫疗法一直在使用该机制，方法是表达能够识别特定癌症免疫原子的TCR。在2016年，HLA-C*08：02限制性TIL（肿瘤浸润淋巴细胞）在肺癌中靶向KRAS（Kirsten大鼠肉瘤病毒）G12D突变，导致阳性结果。在转移性胰腺癌患者中采用了类似的方法，并导致该疾病的消退。HLA-C*08：02限制性TIL对其他新抗原的TCR的研究可能对癌症治疗有益。应用程序K562细胞是HLA I和II类负的，使其成为引入和研究特定单倍型响应的理想细胞模型。hla在供体细胞和个体之间的不匹配可以导致免疫排斥反应，一种选择是敲除内源性HLA，从而使细胞被更广泛地普遍使用。
转录因子的基因沉默，敲除和过表达
摘要背景：番茄（Solanum lycopersicum L.）是全球经济上有价值的作物。由于使用无菌性雄性会降低F1种子产量的成本，因此男性不育的创新对于番茄育种具有重要意义。中止的微孢子基因（AMS）编码为基本的螺旋 - 环螺旋（BHLH）转录因子编码，以前已被指定为拟南芥和水稻中tape虫发育的必不可少的基因。确定SLAM基因的功能（来自S. lycopersicum的AMS基因），并验证它是否是产生番茄中雄性无菌性的潜在候选基因，我们使用病毒诱导的基因沉默（VIGS），CRIS/CAS9介导的介导的基因组编辑和过度表达技术来通过AgrobstermaTer transfote transfortium tomato tonrestim tonrection tonrys tomato。结果：在这里，来自S. lycopersimum的1806 bp的全长猛击基因（登录号MK591950.1）从花粉cDNA克隆。花粉颗粒染色的结果表明，猛击的不可行的花粉比例 - 沉默（75％）， - 敲除（89％）和超过表达植物（60％）明显高于野生型植物（小于10％； p <0.01）。在三种情况下，不可生存的花粉颗粒的形态似乎是四方，循环，萎缩，萎缩或以其他方式形状的形态，而野生型的形态则显得椭圆形和丰满。更重要的是，QRT-PCR分析表明，在大满贯和敲除的植物的花药中的猛击的表达明显低于野生型的表达（p <0.01），但在大量过表达的植物中的表达（p <0.01）（p <0.01）。