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CRISPR-Cas9 介导敲除木薯 CYP79D1 和 CYP79D2 可减弱有毒氰化物的产生
木薯 (Manihot esculenta Crantz) 是一种富含淀粉的块根作物，养活了全世界热带和亚热带地区超过 10 亿人。然而，这种主食会产生有毒的氰化物，需要经过加工才能安全食用。过量食用加工不充分的木薯，再加上缺乏蛋白质的饮食，会对神经退行性产生影响。由于木薯的杂合性质，通过常规育种降低氰化物含量存在问题；重组通常会破坏克隆繁殖品种的一系列理想性状。为了降低木薯中的氰化物水平，我们使用 CRISPR 介导的诱变技术来破坏细胞色素 P 450 基因 CYP79D1 和 CYP79D2，这两个基因的蛋白质产物可催化氰化物葡萄糖苷生物合成的第一步。敲除这两个基因可消除木薯品种 60444 和西非农民偏爱的品种 TME 419 的叶子和块茎中的氰化物。虽然单独敲除 CYP79D2 可显著减少氰化物，但诱变 CYP79D1 则不会，这表明这些旁系同源物的功能已经出现分化。我们的工作表明，木薯基因组编辑可提高食品安全、降低加工要求并带来环境效益，这些优势可轻松扩展到其他农民偏爱的品种。
电子烟暴露对ApoE基因敲除小鼠胰岛素敏感性的影响
心血管疾病，是研究与血脂变化相关疾病的理想动物模型6。因此，本研究旨在通过测定血脂和慢性炎症指标，探讨电子烟暴露对胰岛素敏感性的影响，以明确电子烟的潜在危害。方法动物及吸烟暴露6周龄雄性ApoE基因敲除小鼠48只，购自西安交通大学实验动物中心。研究中使用的饮食按照含0.15%胆固醇和21%脂肪（日本和光公司）的建议配方由北京科奥协利饲料有限公司（北京）配制和供应。所有小鼠随机分为四组：1）含12mg/mL尼古丁的电子烟（电子烟），2）不含尼古丁的电子烟（0mg），3）传统香烟（香烟），4）新鲜空气（对照）。采用仿生模拟人体呼吸系统烟雾发生装置（西安医学院公共卫生学院中心实验室提供），将气烟雾发生装置与进气口对接，保证气密性，气囊装置模拟人体呼吸系统吸收目标气体，烟雾由出气口排至进气口。电子烟组给予市售电子烟，烟碱含量为12 mg/mL，0mg组给予同类型电子烟，但不含烟碱，香烟组给予普通市售过滤嘴香烟，烟碱含量为12 mg/mL，烟碱含量为0.8 mg。对照组给予新鲜空气。每天吸烟3次，每次30 min，共18周。每两周称量一次体重。血糖测定时尾静脉采血。实验结束时，麻醉后处死小鼠，通过心脏穿刺采集血液。血液在 4°C 下以 2000 rpm 离心 20 分钟，血清样本在 -80°C 下保存。所有动物实验均按照西安医科大学（中国陕西）的指导方针进行，并经
tgCRISPRi：使用截短的 gRNA 和催化活性 Cas9 进行有效的基因敲除
CRISPR 干扰 (CRISPRi) 是一种在哺乳动物细胞中沉默基因的高效方法，它采用酶失活形式的 Cas9 (dCas9) 与一个或多个与靶基因转录起始位点互补 20 个核苷酸 (nt) 的向导 RNA (gRNA) 复合。此类 gRNA/dCas9 复合物与 DNA 结合，阻碍目标基因座的转录。在这里，我们提出了一种替代的基因抑制策略，即使用活性 Cas9 与截短的 gRNA (tgRNA) 复合。Cas9/tgRNA 复合物与特定靶位点结合而不会触发 DNA 切割。当靶向转录起始位点附近时，这些短的 14-15 nts tgRNA 可有效抑制果蝇体细胞组织中几种靶基因的表达，而不会产生任何可检测到的靶位点突变。 tgRNA 在与 Cas9-VPR 融合蛋白复合时还可以激活靶基因表达或调节增强子活性，并且可以整合到基因驱动中，其中传统 gRNA 维持驱动，而 tgRNA 抑制靶基因表达。
靶向敲除基因OSHOL1去除水稻植物的甲基碘化物排放
碘缺陷代表了全球一个公共卫生问题。为了增加饮食中碘的量，已经尝试了植物的生物强化策略。他们依靠碘的外源给药来增加其吸收和积累。但是，碘在植物中不稳定，可以通过由无害对臭氧层（HOL）基因编码的特定甲基转移酶的作用挥发为碘化甲基。大气中碘化甲基的释放是由于其臭氧耗竭潜力而对环境的威胁。稻田是碘化甲基最强的生产者之一。因此，碘生物化化的农艺学方法不适合这种作物，从而进一步增加了碘排放。在这项工作中，我们使用了基因组编辑CRISPR/CAS9技术来淘汰稻米基因并研究其功能。oshol1由于淘汰赛废除了该过程，因此导致了碘化甲基甲基生产的主要参与者。此外，它的过表达加强了它。相反，Oshol2的敲除未产生效果。我们的实验有助于阐明水稻基因的功能，提供工具来开发新的水稻品种，并减少碘排放，因此更适合于生物实力化计划而不进一步影响环境。
CRISPR/CAS9核糖核蛋白介导的HTERT-RPE1细胞中的敲除蛋白
图1。使用ssDNA或PCR产物作为HDR模板（a）上部的蛋白质标记的策略示例：据报道编码Centriolar远端附属物蛋白SCLT1的C-末端的基因组序列。带下划线的序列代表CrRNA识别位点，PAM序列为黄色，垂直虚线表示切割位点。鉴于距离内源性终止密码子（BOLD大写字母的TAA）距离为14 bp，插入位点被任意定位为距剪切位点1 bp的位置，即在SCLT1的密码子之间的最接近的交界处。在下部，密码子（上图）和相应的氨基酸性残基（下图）构成了插入物：蓝色大写字母是指可易加的链接器，然后是v5-tag（红色）和附加的外源终止密码子（黑色）。50 bp lha或rha = 50碱基对左同源臂或右同源臂。（b）使用PCR产物作为供体DNA生成具有荧光蛋白（FP）的蛋白质（您最喜欢的蛋白质，YFP）的C端标记的示意图。PCR模板由带有FP，2A元件和电阻盒（R）的标准质粒（左侧）组成。使用一对60mer引物进行PCR反应。在右侧代表了目标基因座（您最喜欢的基因，YFG）的编辑。
量身定制的胞外多糖——CRISPR-Cas9 介导的多粘芽孢杆菌基因组编辑
MoBiTec GmbH pCasPP P. polymyxa 基因组编辑载体 本研究 pCasPP-pepFsg1 pepF 靶向敲除质粒不提供修复模板 本研究 pCasPP-pepFsg1-harms pepF 靶向敲除质粒提供修复模板 本研究 pCasPP-pepFsg2-harms pepF 靶向敲除质粒提供修复模板 本研究 pCasPP-pepF-harms 未靶向的 pCasPP 衍生物携带 pepF 同源区 本研究 pCasPP-pepCsg1-harms pepC 靶向敲除质粒提供修复模板 本研究 pCasPP-pepCsg2-harms pepC 靶向敲除质粒提供修复模板 本研究 pCasPP-pepJsg1-harms pepJ 靶向敲除质粒提供修复模板 本研究 pCasPP-pepJsg2-harms pepJ 靶向敲除质粒提供修复模板 本研究 pCasPP-ugdH1sg1-harms ugdH1 靶向敲除质粒提供修复模板 本研究 pCasPP-ugdH1sg2-harms ugdH1 靶向敲除质粒提供修复模板 本研究 pCasPP-manCsg1-harms manC 靶向敲除质粒提供修复模板 本研究 pCasPP-manCsg2-harms manC 靶向敲除质粒提供修复模板 本研究 pCasPP-clugBlock-harms 多重 pCasPP 变体，同时靶向两个不同位点，用于敲除 18 kb 片段；提供同源区域
Taf1 敲除对胚胎雄性小鼠是致命的，杂合雌性表现出体重和运动障碍
TATA 盒结合蛋白相关因子 1 (TAF1) 是一种普遍表达的蛋白质，也是基础转录因子 TFIID 的最大亚基，在 RNA 聚合酶 II 依赖性转录的启动中起关键作用。人类男性中的 TAF1 错义变异会导致 X 连锁智力障碍（一种神经发育障碍），并且 TAF1 在 X 连锁肌张力障碍（一种神经退行性疾病，帕金森病）中失调。然而，该领域缺乏 TAF1 疾病的遗传小鼠模型来探索其在哺乳动物和治疗中的机制。在这里，我们生成并验证了条件性 cre-lox 等位基因和第一个普遍存在的 Taf1 敲除小鼠。我们发现雄性小鼠的 Taf1 缺失是胚胎致死的，这可能解释了为什么在人类中没有发现无效变体。在 Taf1 杂合雌性小鼠的大脑中，总体结构、整体表达和蛋白质定位没有发现差异，表明 X 失活极度偏向非突变染色体。尽管如此，这些雌性小鼠的体重显著增加，体重随年龄增长而增加，运动减少，这表明一小部分神经元受到 Taf1 缺失的负面影响。最后，这种新的小鼠模型可能是开发 TAF1 疾病治疗的未来平台。
利用 CRISPR 敲除八氢番茄红素去饱和酶基因
在新型植物育种技术 (NPBT) 中，CRISPR/Cas9 系统是用于靶基因编辑的有用工具，可快速改良植物的性状。该技术允许同时靶向一个或多个序列，以及通过同源定向重组引入新的遗传变异。然而，CRISPR/Cas9 技术对于某些多倍体木本植物来说仍然是一个挑战，因为必须同时靶向需要突变的所有不同等位基因。在这项工作中，我们描述了改进的方案，使用农杆菌介导的转化将 CRISPR/Cas9 系统应用于高丛蓝莓 (Vaccinium corymbosum L.)。作为概念验证，我们靶向编码八氢番茄红素去饱和酶的基因，该基因的突变会破坏叶绿素的生物合成，从而可以直观评估敲除效率。离体培养的蓝莓 cv. 的叶片外植体。 Berkeley 已用 CRISPR/Cas9 构建体进行转化，该构建体包含两个针对 pds 两个保守基因区域的向导 RNA（gRNA1 和 gRNA2），随后在富含卡那霉素的选择培养基中维持。在选择培养基中培养 4 周后，分离出卡那霉素抗性株系，并通过 Sanger 测序对这些株系进行基因分型，结果显示基因编辑成功。一些突变株系包括白化表型，即使两种 gRNA 的编辑效率都很低，gRNA1 的编辑效率在 2.1% 到 9.6% 之间，gRNA2 的编辑效率在 3.0% 到 23.8% 之间。这里我们展示了一种非常有效的高丛蓝莓商业品种“伯克利”的不定芽再生协议，以及在 Vaccinium corymbosum L. 中使用 CRISPR/Cas9 系统的进一步改进，为通过生物技术方法介导的育种开辟了道路。
BAd-CRISPR：在成年小鼠肩胛间棕色脂肪组织中诱导基因敲除
CRISPR/Cas9 已实现多种组织中的可诱导基因敲除；然而，尚未有其在棕色脂肪组织 (BAT) 中的应用报道。在此，我们开发了棕色脂肪细胞 CRISPR (BAd-CRISPR) 方法来快速检测一个或多个基因的功能。使用 BAd-CRISPR，将表达单向导 RNA (sgRNA) 的腺相关病毒 (AAV8) 直接施用于在棕色脂肪细胞中表达 Cas9 的小鼠的 BAT。我们表明，将 AAV8-sgRNA 局部施用于成年小鼠的肩胛间 BAT 可强有力地转导棕色脂肪细胞，并使脂联素、脂肪甘油三酯脂肪酶、脂肪酸合酶、周脂素 1 或硬脂酰辅酶 A 去饱和酶 1 的表达降低 90% 以上。施用多个 AAV8 sgRNA 可同时敲除多达三个基因。 BAd-CRISPR 诱导移码突变并抑制靶基因 mRNA 表达，但不会导致 BAT 中脱靶突变的大量积累。我们利用 BAd-CRISPR 创建了可诱导的解偶联蛋白 1 (Ucp1) 敲除小鼠，以评估 UCP1 缺失对成年小鼠适应性产热的影响。可诱导的 Ucp1 敲除不会改变核心体温；然而，BAd-CRISPR Ucp1 小鼠的成纤维细胞生长因子 21 循环浓度升高，并且 BAT 基因表达发生变化，与通过增加过氧化物酶体脂质氧化而产生的热量一致。其他分子适应性预示着额外的细胞效率低下，蛋白质合成和周转增加，线粒体对线粒体编码基因表达的依赖降低，核编码线粒体基因表达增加。这些数据表明 BAd-CRISPR 是一种加速脂肪组织生物学发现的有效工具。
TERMINAL FLOWER 1 基因敲除改变了油菜的开花时间和植株结构
背景：顶花基因1（TFL1）属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白（PEBP）家族，在高等植物花分生组织身份决定及开花时间调控中起重要作用。结果：在油菜基因组中鉴定出5个BnaTFL1基因拷贝。系统发育分析表明，5个BnaTFL1基因拷贝与祖先种芜菁和甘蓝中相应的同源拷贝聚集在一起。BnaTFL1的表达局限于花芽、花、种子、角果和茎组织中，并表现出不同的表达谱。利用CRISPR/Cas9技术产生的BnaC03.TFL1敲除突变体表现出早花表型，而其他基因拷贝的敲除突变体开花时间与野生型相似。此外，BnaTFL1基因单个拷贝的敲除突变体表现出了植株结构的改变，BnaTFL1突变体的株高、分枝起始高度、分枝数、角果数、每角果种子数和主花序上的角果数均显著减少。