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CRISPR/Cas9 基因敲除及随后的野生型和突变型基因拯救的改进策略
将荧光标记 mOrange 插入到流行的 pLentiCrispr-V2 中，以创建包含嘌呤霉素选择和荧光标记的 pLentiCrispr-V2-mOrange (V2mO)，使病毒产生和靶标转导可见。用该质粒和适当的向导 RNA (gRNA) 包装的慢病毒成功敲除了人胃癌细胞系中的 RhoA、Gli1 和 Gal3 基因。Cas9-gRNA 编辑效率可以直接从 Cas9-gRNA 转导细胞中 gRNA 区域周围的短聚合酶链反应产物的 Sanger 电泳图来估计。必须对转导的靶细胞池进行单克隆以建立稳定的敲除克隆。仅当 gRNA 结合的 cDNA 被三个核苷酸修饰而氨基酸序列保持不变时，才能成功将野生型（RhoA 和 Gal3）和突变型（RhoA.Y42C）基因拯救到敲除细胞中。在 Gal3 基因中观察到严格的靶向 CRISPR/Cas9 编辑，但在 RhoA 基因中未观察到，因为 RhoA.Y42C 已经在 gRNA5 结合位点出现核苷酸变化。总之，我们改进的策略增加了这些优势：在流行的慢病毒系统中添加可视化标记、监测慢病毒的生产和转导效率、通过荧光激活细胞分选在靶细胞中分选 Cas9+ 细胞、通过 gRNA 结合位点周围的短 PCR 电泳图直接估计靶细胞池的基因编辑效率、以及在敲除细胞中成功拯救野生型和突变型基因，通过修饰 cDNA 克服 Cas9 编辑。
通过 CRISPR/Cas9 基因敲除绵羊的 MSTNDel273C 突变促进骨骼肌肌纤维增生
。CC-BY 4.0 国际许可证可在未经同行评审认证的情况下获得）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是
缩回：优化SGRNA来改善CRISPR/CAS9敲除效率：特别关注人类和动物细胞
近年来，在各种情况下（医疗，工业等）中非侵入性脑界面（BCI）设备的扩展和应用的扩展为标志。这项技术允许代理“直接用思想行动”，绕过外围运动系统。有趣的是，值得注意的是，典型的非侵入性BCI范式与人类自愿行动的神经科学模型保持远距离。值得注意的是，在BCI实验中，动作和感知之间的双向联系不断忽略。在当前的观点文章中，我们提出了一种创新的BCI范式，该范式直接受到意识运动原则的启发，该原则假定自愿行动是由即将到来的感知效应的预期代表所驱动的。我们认为（1）适应BCI范式可以允许简单的动作效应结合和因此作用效应预测，并且（2）使用这些动作效应预测的神经基础作为AI方法中感兴趣的特征，可能导致更准确和自然主义的BCI BCI介导的动作。
通过 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白和基于 URA3 的标记回收对炭疽菌进行有效的多基因敲除
图 1. CRISPR-Cas9 RNP 促进 C. higginsianum 中与供体 DNA 的同源重组。（a）CRISPR-Cas9 RNP 介导的 HDR 示意图。首先，将重组 Cas9 蛋白（橙色）和针对目的基因 (GOI) 的合成 gRNA（洋红色）在体外混合以形成 RNP。其次，用 RNP 和供体 DNA 转化 C. higginsianum 原生质体，其中供体 DNA 具有选择标记 NPTII，两侧是两个同源臂。最后，通过结合选择培养基和基于 PCR 的筛选来分离用选择盒替换 GOI 的菌株。（b）URA3 敲除的构建设计。供体 DNA 具有选择标记，即 NPTII 表达盒，两侧是 0.5 kb 的同源臂，以浅灰色框表示。箭头表示扩增 ura3 基因组中特异性存在的“片段 1”和“片段 2”的引物。（c）转化子数量和 URA3 敲除率。左图显示每板转化子数量，右图显示每板 URA3 敲除率（n =5）。“-gRNA”和“+gRNA”分别代表不含和含 gRNA 的结果。星号表示统计差异（p < 0.001，Welch t 检验）。通过 PCR 筛选评估 URA3 的敲除，如 (d) 所示。（d）ura3 突变体的 PCR 筛选。使用 (b) 中所示的引物组，在含有 500 µg/ml G418 的 MA 上使用每个菌落进行 PCR。显示了从 -gRNA 和 +gRNA 转化子中随机选择的七个菌落的结果。 C. higginsianum 肌动蛋白基因 (CH63R_04240) 的 238 bp 片段被指定为肌动蛋白。凝胶左侧的数字表示 DNA 大小标记 (bp) 的位置。
通过碱基编辑环化外显子的反向剪接位点敲除环状RNA
引言与连接上游 5′ 剪接位点 (ss) 和下游 3′ ss 的经典剪接不同，反向剪接将下游 5′ 反向剪接位点 (bss) 与上游 3′ bss 连接，产生共价闭合的环状 RNA (circRNA) [1-7]。尽管反向剪接的加工方式不利，但它由与经典剪接相同的剪接体机制催化 [8-10]，表明它们之间存在直接竞争 [11]。此外，反向剪接也受顺式元件和反式因子的严格调控 [10,12-16]，导致 circRNA 在所检测的广泛细胞系、组织和物种中呈现时空表达 [17-25]。越来越多的证据表明，circRNA 表达失调与人类疾病有关，如癌症 [ 26 – 29 ]、系统性红斑狼疮 [ 30 ] 和神经元变性 [ 31 , 32 ]，表明它们在生理和病理条件下都发挥着潜在作用 [ 1 , 2 , 5 ]。从机制上讲，大多数 circRNA 位于细胞质中，有些被发现充当 miRNA 或蛋白质的诱饵 [ 12 , 15 , 19 , 22 , 30 , 32 , 33 ]。尽管如此，大多数 circRNA 的生物学意义仍未被充分探索，部分原因是其功能研究方法有限，例如 DNA 水平上的 circRNA 敲除 (KO)。例如，CRISPR/Cas9 基因组编辑去除了
使用基因敲除小鼠和工程软骨来鉴定具有骨关节炎高风险的遗传变异
Tillgren V 、Ho JCS、Önnerfjord P、Kalamajski S。新型富含亮氨酸的小蛋白软骨粘连素样 (CHADL) 在软骨中表达并调节软骨细胞分化。生物化学杂志。2015 年；290(2):918-925。doi: 10.1074/jbc.M114.593541。Styrkarsdottir U 等人。全基因组测序确定了与髋关节骨关节炎高风险相关的 COMP 和 CHADL 中的罕见基因型。自然遗传学。2017 年；49(5):801-805。doi: 10.1038/ng.3816。D'Costa S、Rich MJ、Diekman BO。由纯合敲除细胞周期抑制剂 p21 的原代人类软骨细胞制成的工程软骨。正在出版，《组织工程》。
用于基因敲除和转录调控的 PAM 柔性 Cas9 变体的高通量筛选
1. 纽约基因组中心，纽约，纽约州，美国 2. 纽约大学生物学系，纽约，纽约州，美国 3. 这些作者贡献相同 * 电子邮件：neville@sanjanalab.org 关键词：Cas9、诱变、汇集 CRISPR 筛选、CRISPRa、CRISPRi、原间隔区相邻基序
OR39 的敲除揭示了调节疟蚊宿主寻求习得的嗅觉通路的冗余
在成虫成熟过程中，嗜人蚊对人类宿主线索（如体味和二氧化碳）的吸引力逐渐增强。这种寻找宿主行为的习得与嗅觉受体 (OR) 转录本丰度和嗅觉传感神经元 (OSN) 敏感性的年龄依赖性变化相关。人类疟疾媒介按蚊 (Anopheles coluzzii) 的一个 OR 基因 AcolOR39 在成熟雌性中显著下调，而 AcolOR39 的同源配体 sulcatone（人类散发的主要成分）介导了观察到的新生雌性对人体气味的行为抑制。使用 CRISPR – Cas9 诱变敲除 AcolOR39 ，选择性地消除了位于毛状感器中的 OSN 对 sulcatone 的检测。然而，敲除 AcolOR39 既不会改变风洞中幼虫雌性的反应率，也不会改变其飞行行为，这表明在调节蚊子寻找宿主能力的获得方面，还有其他基因参与其中，因此存在冗余。
人类CD34+造血茎和祖细胞中的基因敲除以及小鼠的人类免疫系统
人类CD34 +造血干细胞和祖细胞（HSPC）是临床HSC移植的标准细胞来源，以及实验性异种移植，以产生“人性化小鼠”。为了进一步扩展这些人源性小鼠的应用范围，我们开发了一种方案，以在移植前有效地编辑人CD34 + HSPC的基因组。过去，操纵HSPC在体外培养过程中本质上难以转导，并且在体外培养过程中迅速失去其干性和植入潜力，这使操纵HSPC变得复杂。然而，使用SGRNA的优化核反射：CAS9核糖核蛋白复合物，我们现在能够在具有几乎100％效率的CD34 + HSPC中编辑候选基因，并在具有高I IntrineAge srimineage syprineage hampopooietic smatopoietic的较高的小鼠中将这些修饰的细胞移植在免疫缺陷的小鼠中。结果是一种人源化的小鼠，我们从中从其人类免疫系统中删除了感兴趣的基因。
仅敲除 LincRNA#1 不会影响凯尔特 POLLED 等位基因杂合牛的无角表型
长基因间非编码 RNA（lincRNA#1）在无角牛胎儿的角芽区过度表达，表明其可能在角芽抑制中发挥作用。使用基因组编辑来测试此序列的缺失是否与角表型有关。将两个具有高突变效率的 gRNA 靶向 lincRNA#1 序列两侧的 5′ 和 3′ 区域，在授精后 6 小时与 Cas9 一起作为核糖核蛋白复合物注射到牛受精卵（n = 121）中。在产生的囊胚（n = 31）中，84% 具有预期的 3.7 kb 缺失；在这些具有 3.7 kb 缺失的胚胎中，88% 是双等位基因敲除。将 39 个推测已编辑的 7 天囊胚移植到 13 头同步受体母牛体内，导致 10 例妊娠，其中 5 个胚胎在 POLLED 基因座上为显性 PC POLLED 等位基因杂合子，5 个胚胎为隐性 pp 基因型。产生的胎儿中有 8 个 (80%) 为双等位基因 lincRNA#1 敲除，其余两个为嵌合体。RT-qPCR 分析用于确认敲除胎儿中不存在 lincRNA#1 表达。对基因型 (PC p) POLLED 、lincRNA#1 敲除胎儿的表型和组织学分析显示，其形态与未编辑的对照无角胎儿相似，表明仅缺乏 lincRNA#1 不会导致有角表型。