整合系统

基于 CRISPR/Cas9 的多拷贝整合系统用于黑曲霉中的蛋白质生产

丝状真菌黑曲霉因其高蛋白质分泌能力而闻名，是同源和异源蛋白质生产的首选宿主。为了进一步提高黑曲霉的蛋白质生产能力，我们制备了一组专用的蛋白质生产菌株，其在基因组的预定位置包含多达 10 个葡糖淀粉酶着陆位点 (GLS)。这些 GLS 取代了编码大量存在或编码不需要的功能的酶的基因。每个 GLS 都包含葡糖淀粉酶基因 (glaA) 的启动子和终止子区域，该基因是黑曲霉中表达最高的基因之一。整合多个基因拷贝（通常通过随机整合实现）可提高蛋白质产量。在我们的方法中，GLS 允许使用 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑快速进行靶向基因替换。通过在每个 GLS 中引入相同或不同的独特 DNA 序列（称为 KORE 序列）并设计 Cas9 兼容的单向导 RNA，人们能够选择目标基因在哪个 GLS 整合。通过这种方式，可以轻松快速地制备一组具有不同目的基因拷贝数的相同菌株，以比较蛋白质生产水平。为了说明其潜力，我们成功地利用表达平台生成多拷贝 A. niger 菌株，该菌株产生 Penicillium expansum PatE::6xHis 蛋白，催化棒曲霉素生物合成的最后一步。表达 10 个拷贝 patE::6xHis 表达盒的 A. niger 菌株在培养基中产生约 70 lg mL 1 PatE 蛋白，纯度略低于 90%。